基于網絡藥理學和分子對接探討黃藥子-夏枯草-五味子治療亞急性甲狀腺炎的作用機制*

賈慧雨，呂娜，馮志海

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南省中醫藥研究院附屬醫院，河南 鄭州 450000； 3.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450001

亞急性甲狀腺炎(subacute thyroiditis，SAT)是一種最常見的痛性甲狀腺炎，發病大多與病毒感染有關，也可發生于非病毒感染之后[1]。本病高發人群為30～50歲女性，主要特征為甲狀腺部位疼痛，還可能伴有肌肉疼痛、心動過速、發熱、食欲減退等全身癥狀，病程大多2～4個月，病情嚴重者常因疼痛明顯而影響日常工作和休息。目前，西醫治療SAT主要通過應用非甾體類抗感染藥或糖皮質激素來控制炎癥，雖起效較快，但易產生不良反應，且容易反復發作。中醫藥治療SAT不僅安全性更高，且可降低復發率。黃藥子-夏枯草-五味子是仝小林院士提出的治療SAT的靶向藥[2]，療效確切，但其具體作用機制尚不明確。

網絡藥理學整體性與系統性的特點恰與中醫傳統文化中的整體觀念、辨證論治的思想相對應，同時網絡藥理學“疾病-基因-靶點-藥物”的研究模式與多味中藥“多成分、多靶點、多途徑”的作用特點相呼應[3]。因此，通過網絡藥理學方法研究黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的作用機制有其獨特優勢，并采用分子對接技術驗證研究結果的可靠性。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點收集通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃藥子、夏枯草、五味子的化學成分，以口服利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為條件進行篩選，獲取黃藥子、夏枯草、五味子的有效成分。同時基于TCMSP獲取黃藥子、夏枯草、五味子有效成分的作用靶點，使用Uniprot數據庫(http//www.uniprot.org/)將靶點轉化為標準基因名。

1.2 SAT疾病靶點及黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點的獲取在人類基因數據庫(GeneCards，https：//www.genecards.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)及人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)中以“subacute thyroiditis”為關鍵詞搜索SAT相關靶點。運用venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線繪制韋恩圖，得到黃藥子-夏枯草-五味子有效成分相關靶點與SAT相關靶點的交集靶點，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點。

1.3 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選在STRING數據庫(https：//www.string-db.org/)中導入黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在靶點，將物種設置為人(homo sapines)，將置信度得分閾值設置為high confidence=0.700，隱藏網絡中的游離節點，得到潛在靶點蛋白相互作用關系。使用Cytoscape 3.7.2 構建PPI網絡，并進行拓撲分析，根據度值(degree)、緊密中心性(closeness centrality，CC)及中介中心性(betweenness centrality，BC)篩選黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的關鍵靶點。

1.4 富集分析將潛在靶點導入Metascape數據庫(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，設置物種為人類，進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并以P<0.01為條件進行篩選分析，使用微生信在線工具(http：//www.bioinformatics.com.cn/)將富集結果可視化。

1.5 “關鍵成分-潛在靶點-通路-疾病”網絡構建與拓撲分析利用Excel找出潛在靶點涉及的中藥成分，使用Cytoscape 3.7.2構建黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的“關鍵成分-潛在靶點-通路-疾病”網絡，并進行拓撲分析。

1.6 分子對接驗證分別選取度值排名前3位的關鍵靶點和成分作為受體蛋白和配體小分子。在PDB數據庫(http：//www1.rcsb.org/)中獲取受體蛋白的晶體結構并下載其pdb格式文件，從TCMSP數據庫下載配體小分子的MOL2結構式，使用AutoDockTools 1.5.6對配體和受體進行分子對接，并使用Pymol將分子對接結果可視化。

2 結果

2.1 黃藥子-夏枯草-五味子的有效成分及靶點通過TCMSP數據庫共篩選到黃藥子有效成分15個，夏枯草有效成分11個，五味子有效成分8個，其中包括黃藥子與夏枯草共有成分4個。在TCMSP數據庫中查找各成分對應靶點，經查詢發現黃藥子素I、黃藥子素H無對應靶點信息，將其剔除后共28個有效成分。利用Uniprot數據庫中將靶點轉換為標準基因名，整合重復靶點后共獲取220個藥物靶點。見表1。

2.2 SAT疾病靶點及黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點以“subacute thyroiditis”為檢索詞在GeneCards數據庫中以“≥3.68(score值中位數)”為條件共搜集到768個疾病相關靶點，在OMIM數據庫中共搜集到49個疾病相關靶點，在Drugbank數據庫中共搜集到44個疾病相關靶點，去重整合后共有826個SAT相關靶點。運用venny 2.1.0在線繪制韋恩圖，得到黃藥子-夏枯草-五味子有效成分相關靶點與SAT相關靶點的交集靶點103個，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在作用靶點。見圖1。

2.3 PPI網絡構建及關鍵靶點篩選在STRING數據庫輸入103個潛在靶點，得到蛋白質相互作用關系，將結果導入Cytoscape 3.7.2構建PPI網絡，結果顯示，網絡中共有103個節點和1 017條邊，節點平均degree為19.7，且節點大小、顏色深淺與degree正相關。拓撲分析顯示，degree中位數為44，CC中位數為 0.633 540 37，BC中位數為 0.002 952 07，篩選出degree、CC、BC均大于中位數的靶點共42個，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的潛在關鍵靶點。見表2，圖2。

表2 黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的前10位關鍵靶點

圖2 黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT關鍵靶點PPI網絡圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析將103個潛在靶點輸入Metascape數據庫，物種選擇人類，設置P<0.01，Min Overlap=3，Min Einrichment=1.5。GO富集分析篩選出6 448個條目，涉及對無機物的反應(response to inorganic substance)、凋亡信號途徑(apoptotic signaling pathway)、氧化應激(response to oxygen levels)等生物過程(biological processes，BP)5 374個條目，膜筏(membrane raft)、細胞質的核周區域(perinuclear region of cytoplasm)、囊腔(vesicle lumen)等細胞組成(cellular components，CC)407個條目，轉錄因子結合(transcription factor binding)、蛋白結構域特異性結合(protein domain specific binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等分子功能(molecular functions，MF) 667個條目。KEGG通路分析共富集出癌癥途徑(pathways in cancer)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)等438條通路，將count值排名前20的通路作為重要通路。見圖3、圖4。

圖3 GO富集分析圖

圖4 KEGG通路富集分析圖

2.5 “關鍵成分-潛在靶點-通路-疾病”網絡構建及核心成分篩選103個潛在靶點對應黃藥子有效成分9個，夏枯草有效成分8個，五味子有效成分6個，含黃藥子和夏枯草共同成分4個。利用Cytoscape 3.7.2構建“關鍵成分-潛在靶點-通路-疾病”網絡，并進行拓撲分析及可視化。結果顯示，網絡中共有143個節點、608條邊，其中三角形代表相關作用通路，菱形代表疾病，橙色圓形代表潛在作用靶點，綠色六邊形代表關鍵成分，節點越大、顏色越深，degree越大。對網絡中的關鍵成分進行拓撲分析發現有19種關鍵成分，即為黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的關鍵成分，其中度值排名前3的分別為槲皮素、木犀草素、山奈酚。見圖5。

圖5 “關鍵成分-潛在靶點-通路-疾病”網絡圖

2.6 分子對接驗證將p53腫瘤蛋白(tumor protein p53，TP53)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα，AKT1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)作為受體蛋白，槲皮素、木犀草素、山奈酚作為配體小分子，使用AutoDockTools1.5.6對蛋白進行去水、加氫處理，對小分子進行加氫處理。使用AutoDock進行分子對接，并計算出靶點蛋白與小分子化合物之間的最低結合能，對接結果顯示結合能全部小于-5 kcal·mol-1，表明受體與配體之間結合良好，且TP53與木犀草素、AKT1與山奈酚及IL-6與山奈酚的結合能最低。使用Pymol將分子對接結果可視化。見表3，圖6。

表3 分子對接結合能

圖6 分子對接結果

3 討論

目前，SAT的發病機制不甚清晰，可能和病毒感染所致的自身免疫反應有關[4]，臨床中也發現SAT患者有時可有甲狀腺自身抗體滴度的升高。黃藥子-夏枯草-五味子是仝小林院士提出的治療SAT的靶向藥。黃藥子性味苦、寒，有小毒，《本草綱目》描述其具有“涼血、降火、消癭、解毒”之功效，在甲狀腺疾病以及瘡瘍腫毒等病癥的治療中往往頗有成效[5]。臨床研究顯示，在中藥湯劑中加入黃藥子治療SAT可減少發熱、疼痛，縮短甲狀腺腫大消退時間，促進血沉恢復[6]。但黃藥子有小毒，具有一定的肝腎毒性，且與給藥劑量、時間有關[7]，因此合理、規范用藥尤為重要。《本草經疏》記載：“藥子之類，少服，止可外敷。”《中藥學》規定黃藥子用量為 5～15 g，《中醫內科學》建議不宜超過10 g。臨床中黃藥子煎湯內服常用劑量為3～9 g，且不宜長期服用，以免造成肝腎損害。另外，合理配伍五味子、黃芩、黃柏、當歸、甘草等可對黃藥子起到減毒增效之功[8-9]。夏枯草作為藥物最早見于《神農本草經》云：“味苦辛、寒。主寒熱、瘰疬、鼠瘺、頭瘡、破癥，散癭結氣，腳腫濕痹。”研究表明，夏枯草顆粒聯合常規西藥治療SAT較對照組改善實驗室指標、臨床癥狀更佳，且復發率更低[10]。五味子酸甘性溫，肝體陰而用陽，酸甘之味斂陰可養肝體、助肝陽，現代藥理研究發現，其具有保肝功效，可減輕黃藥子的肝毒性[11]。三藥合用具有清肝瀉火、消癭散結、斂肝護肝之效，在臨床治療SAT時常可取得滿意療效。

本研究運用網絡藥理學方法篩選到黃藥子-夏枯草-五味子有效成分28種，提示黃藥子-夏枯草-五味子中多種成分共同發揮作用治療SAT。其中度值排名前3位的槲皮素、木犀草素、山奈酚均具有抗感染、抗病毒及免疫調節等作用[12-18]。研究表明，槲皮素可能通過參與調控 NF-κB/Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路，抑制炎性因子、趨化因子及炎性細胞介質的表達而發揮抗感染作用[19]。木犀草素主要以黃酮苷(木犀草苷、葒草素及異葒草素)的形式存在，可顯著抑制IκB激酶β亞基(IκB kinaseβ，IKKβ)和κB抑制因子α亞基(α inhibitor of κB，IκBα)磷酸化，減少細胞核中p65表達量，抑制NF-κB信號通路以發揮抗感染活性，葒草素還可促進核因子E2相關性因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)的表達和核移位從而發揮良好的抗氧化作用[20]。山奈酚除抗感染作用外，還可調節甲狀腺激素的合成[21]。

本次研究篩選出TP53、AKT1、IL-6、TNF、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、半胱天冬酶3(caspase 3，CASP3)等42個黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的關鍵靶點。研究發現，TP53、AKT1通過調控miRNA的表達，誘導細胞分化和凋亡，調節細胞周期，參與炎癥反應過程[22-24]。IL-6作為經典的炎性細胞因子，可調節細胞的生長和分化，參與炎癥和免疫反應過程[25-26]。TNF抑制劑的應用可能誘導SAT的發生，其機制可能與細胞因子失衡有關[27]。VEGFA可使新生血管形成、增加血管通透性，在許多炎癥性疾病中發揮作用[28-30]。由此推測，黃藥子-夏枯草-五味子有效成分可作用于多個靶點通過發揮抗感染、免疫調節、調節細胞周期、抑制細胞凋亡等作用治療SAT。

GO富集分析結果表明，黃藥子-夏枯草-五味子可能通過膜筏、囊腔、細胞質核周區域等細胞成分參與調節對無機物的反應、氧化應激、細胞凋亡等生物過程從而發揮轉錄因子結合、蛋白結構域特異性結合、蛋白激酶活性等分子功能，發揮治療SAT的作用。KEGG通路富集分析表明，黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT的通路主要包括PI3K/AKT通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、甲狀腺激素信號通路等。研究表明，激活PI3K/AKT通路，上調PI3K及AKT的磷酸化水平，可促進甲狀腺功能恢復，并抑制炎癥發生[31]。TNF信號通路、NF-κB 信號通路及MAPK信號通路均為與炎癥反應、免疫應答及細胞凋亡相關的重要通路[32-34]。甲狀腺激素信號通路與甲狀腺激素水平直接相關，本研究亦表明TP53、AKT1均在此通路中表達。由此可推測，黃藥子-夏枯草-五味子有效成分可通過炎癥反應、免疫應答、調節細胞周期與甲狀腺激素水平等途徑治療SAT。

分子對接結果表明，核心成分與靶點之間具有良好的結合活性，與TP53結合最穩定的成分為木犀草素，與AKT1、IL-6結合最穩定的成分為山奈酚，預測木犀草素和山奈酚在黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT中發揮關鍵作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學構建了黃藥子-夏枯草-五味子的網絡模型，篩選出其有效成分，并分析其潛在靶點和相關通路，探究了黃藥子-夏枯草-五味子主要有效成分及潛在靶點治療SAT的作用機制，表明黃藥子-夏枯草-五味子治療亞急性甲狀腺炎是多種成分通過多條通路作用于多個靶點的結果，分子對接結果表明，核心成分與核心靶點結合良好，為臨床應用黃藥子-夏枯草-五味子治療SAT提供了思路，為今后的相關體內外實驗提供理論基礎。但本研究仍有不足之處，如數據收集尚不十分全面，由于條件限制尚未進行體內外實驗，后期有待深入研究，以進一步驗證本研究結果。