基于網絡藥理學探討牛膝-鉤藤藥對治療糖尿病合并高血壓的作用機制

喻詩雯，齊月

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110085； 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以胰島素抵抗及胰島β細胞功能障礙為主要病理因素，常伴有蛋白質、脂質及碳水化合物代謝受損的慢性疾病[1]。高血壓是一種公認的影響心血管、腎臟及外周動脈系統的重要危險因素[2]。兩種疾病關系密切，50%～80%的2型糖尿病患者會出現高血壓，其中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)和交感神經系統(sympathetic nervous system，SNS)的不適當激活、線粒體功能障礙、氧化應激、炎癥、細胞外囊泡異常釋放(extracellular vesicles，EVs)和相關的microRNAs(miRs)及腸道微生物群和腎臟鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2)失調，逐漸成為胰島素抵抗和2型糖尿病誘發的高血壓發展的潛在機制[3]?！芭Ｏ?鉤藤”作為常用配伍藥對，廣泛應用于糖尿病合并高血壓的治療[4]，二者均歸肝經，在平肝、清肝的同時，又起到了補益肝腎、活血逐瘀的作用。同時牛膝、鉤藤也被證實有顯著的降血壓[5]、降血糖[6]效果。本研究從分子機制角度出發，以網絡藥理學多成分、多靶點相互作用的特點為依據，與中醫辨證“整體”“統一”“關聯”的思維相契合[7]，挖掘牛膝-鉤藤藥對潛在活性成分，預測其治療糖尿病合并高血壓的靶點通路，從大數據分析層面總結出中藥治療糖尿病合并高血壓的獨特優勢。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及關鍵靶點篩選基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索牛膝、鉤藤的化學成分，依據藥動學性質參數(absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME)，將口服生物利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18作為篩選條件，獲得牛膝、鉤藤的活性成分。通過TCMSP預測牛膝、鉤藤活性成分的相關作用靶點，刪除未檢索出相關靶標的化合物，并使用Uniprot數據庫將所得靶點進行標準化。利用Cytoscape 3.7.2軟件將牛膝-鉤藤共同靶點與藥物活性成分進行映射，獲得“藥物-活性成分-靶點”相互作用網絡圖。

1.2 疾病靶點和“藥物-疾病”交集靶點的獲取以“diabetic mellitus”“hypertension”作為檢索詞，分別在人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)、人類基因數據庫(GeneCards，https：//www.genecards.org/)、DrugBank數據庫(https：//go.drugbank.com/)及療效藥靶數據庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)中篩選糖尿病、高血壓病的相關靶點，合并并刪除重復靶點后與活性成分相關靶點進行映射，初步得到活性成分與疾病的交集靶點，即為牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在作用靶點，并繪制“活性成分-疾病”交集靶點韋恩圖。

1.3 交集靶點蛋白相互作用網絡構建及核心靶點篩選將交集靶點輸入STRING在線分析平臺(https：//cn.string-db.org/)，交互分數設定>0.4，得到蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)關系，將所得數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建PPI網絡。利用CentiScaPe 2.2插件分析網絡拓撲參數，最終篩選出牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在核心靶點。

1.4 富集分析采用基因注釋和資源分析數據庫(Metascape，https：//metascape.org/)對牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在核心靶點進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。其中，GO功能富集分析包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)及細胞組成(cell component，CC)。

1.5 “活性成分-核心靶點-通路-疾病”網絡的構建選取前30條主要參與的信號通路與核心靶點、藥物活性成分進行映射，導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“活性成分-核心靶點-通路-疾病”網絡圖。

2 結果

2.1 牛膝-鉤藤活性成分篩選結果通過TCMSP數據庫檢索出皂苷類、多糖類及甾酮類為牛膝主要活性成分；生物堿類物質，包括鉤藤堿及異鉤藤等是鉤藤的主要活性成分。根據OB≥30%及DL≥0.18進行篩選并刪除未檢索出相關靶標的化合物，得到牛膝成分14個、鉤藤成分29個，相同活性成分3個。見表1。

表1 牛膝-鉤藤主要活性成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡構建通過TCMSP平臺獲取46個活性成分的相關靶點，剔除各活性成分重復靶點與假陽性靶點后，共篩選出牛膝-鉤藤活性成分作用靶點199個，將活性成分與作用靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得“藥物-活性成分-靶點”網絡圖。圖中共有244個節點、892條邊，節點表示藥物、活性成分、靶點，邊表示它們之間的相互作用關系，藍綠色正方形代表藥物，綠色、橙色、粉色正八邊形分別代表牛膝、鉤藤及共有活性成分，藍色菱形代表靶標基因。在牛膝中，活性成分槲皮素對應靶點數目最多，為75個，其次為山奈酚、漢黃芩素。在鉤藤中，同樣為共有成分槲皮素、山奈酚對應靶點數目最多，其次為β-谷甾醇。該網絡可直觀地表現出牛膝-鉤藤藥對治療糖尿病合并高血壓是通過多成分、多靶點來取得成效，其中槲皮素和山奈酚可能是核心活性成分。見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖

2.3 疾病靶點篩選及韋恩圖的繪制通過OMIM、GeneCards、DrugBank及TTD數據庫分別檢索糖尿病及高血壓的靶基因，得到糖尿病相關靶點909個，高血壓相關靶點906個，剔除重復靶點后，共得到糖尿病合并高血壓靶點1494個。利用韋恩圖在線繪制網站生成“活性成分-疾病”靶點韋恩圖，得到交集靶點104個。見圖2。

圖2 “活性成分-疾病”靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡圖與核心靶點篩選利用STRING在線分析平臺，交互分數設定>0.4，生成蛋白互作關系，將所得數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建PPI網絡。圖中共有104個節點、1 279條邊，節點表示蛋白，邊表示它們之間的相互作用關系。利用CentiScaPe 2.2插件分析網絡拓撲參數，得出Degree值，以Degree值>24.59作為篩選條件，最終獲得牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的潛在核心靶點47個，包括白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα，AKT1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、前列腺素內過氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)等，這些靶蛋白可能是牛膝-鉤藤治療糖尿病合并高血壓的關鍵靶點。見圖3。

圖3 交集靶點蛋白互作網絡圖

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析利用Metascape數據庫對篩選出的核心靶點進行GO分析，設置P<0.01，最小計數為3，且富集因子>1.5，共得到生物過程(biological process，BP)1004條，主要包括對脂多糖的反應、細胞對脂質的反應、對細胞因子的反應、對活性氧的反應及炎癥反應等；分子功能(molecular function，MF)32條，主要包括轉錄共調節子結合、細胞因子受體結合、轉錄共激活因子結合、蛋白激酶活性等；細胞組成(cell component，CC)84條，主要包括細胞膜上的膜筏、囊泡腔、轉錄調節復合物、細胞外基質等。KEGG通路富集分析得出153條信號通路，主要包括晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE)信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、叉頭框蛋白(Forkhead box O，FoxO)信號通路、磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/ AKT信號通路等。見圖4、圖5。

圖4 GO分析柱狀圖

圖5 前30位信號通路氣泡圖

2.6 “活性成分-核心靶點-通路-疾病”網絡的構建選取前30條主要參與的信號通路與核心靶點、藥物活性成分進行映射，導入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“活性成分-核心靶點-通路-疾病”網絡圖。圖中共有120個節點、696條邊，節點表示藥物主要活性成分、信號通路、靶點、疾病，邊表示它們之間的相互作用關系，綠色正八邊形代表牛膝、鉤藤及共有活性成分，藍色倒三角形代表信號通路，黃色菱形代表核心靶點，粉色正方形代表疾病。由此可清晰看出，牛膝-鉤藤藥對是通過多成分、多靶點影響TNF、IL-17等信號通路干預并治療糖尿病合并高血壓。見圖6。

圖6 “活性成分-核心靶點-通路-疾病”網絡圖

3 討論

中醫認為，糖尿病與高血壓往往互相為患，因先天之精虧虛、飲食不節、憂思煩勞而致陰虛耗氣、耗液，日久累及腎臟，氣陰兩傷，陰虛火旺，消渴先發為病，繼而虛火上蒸肺胃，耗傷肝腎精血，則引動少陽相火亢逆，累及脾胃，則煉液成痰，上至頭目，則引發頭暈目眩等癥狀。久而久之，陰陽兩虛而致浮陽上擾，最終導致消渴間雜眩暈更為遷延難愈[8]。牛膝具有補益肝腎、祛瘀通絡的功效，而其引血下行之功對陰虛陽亢型高血壓病有獨特療效[9]。鉤藤為清熱平肝之良藥，其常用組方天麻鉤藤飲是當前中醫治療肝陽上亢型高血壓病的經典名方[10]。因此，兩藥相伍治療糖尿病合并高血壓共奏“清上引下”之效，既治肝陽上亢之標，又治陰虛火旺之本。

現代藥理學研究顯示，牛膝中含豐富的三萜化合物，其中主要為牛膝皂苷類及多糖類[11]。牛膝總皂苷(achyranthes bidentata saponin，ABS)通過其抑制促炎因子的作用，在治療腰、膝關節炎癥方面應用廣泛[12-13]。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharide，ABP)聯合牛膝甾酮皂苷可對軟骨細胞損傷產生增益作用，對抗骨質疏松[14]。同時經ABP處理小鼠細胞24 h后，IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達水平顯著增加，表明ABP可通過調節基因表達刺激巨噬細胞分泌細胞因子及一氧化氮(nitric oxide，NO)，達到舒張血管、保護內皮功能的作用[15]。鉤藤總生物堿(rhynchophylla total alkaloid，RTA)是鉤藤的主要活性成分[16]，研究表明，自噬可防止細胞凋亡，RTA可通過促進細胞自噬，減少低密度脂蛋白(oxidation of LDL，ox-LDL)誘導人臍靜脈內皮細胞中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)累積，減輕氧化損傷，并增加自發性高血壓模型大鼠血清中的NO含量和主動脈中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達從而改善內皮血管舒張。同時，研究顯示，RTA可顯著上調p-AMPK(Thr-172)的表達，表明RTA對自噬的促進作用導致腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的激活，而AMPK的激活又可通過增加eNOS表達和促進NO產生來改善內皮功能[17]。

本研究篩選出牛膝-鉤藤藥對的主要活性成分為槲皮素、山奈酚、漢黃芩素以及β-谷甾醇等，其治療糖尿病合并高血壓的核心靶點主要為IL-6、AKT1、TNF、VEGFA及MAPK3等。研究表明，胰島素抵抗與脂肪組織代謝及慢性低度炎癥密切相關，脂肪組織、骨骼肌中的促炎細胞因子，如TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和IL-6，以及促炎酶，如環氧合酶(cyclooxygenase，COX)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的水平升高，會導致胰島素抵抗的發展[18-19]。槲皮素可降低TNF-α、IL-6、IL-1β和COX-2的基因表達水平，抑制核轉錄因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)的激活和c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的產生并升高脂肪組織中解偶聯蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)的水平，上調AMPK磷酸化和沉默信息調節劑(sirtuin1，Sirt1)的表達，以此減少脂肪組織的巨噬細胞浸潤，降低促炎介質的水平，改善胰島素抵抗[20]。槲皮素還通過與抗氧化酶相互作用，如血紅素加氧酶-1(heme oxygenase，HO-1)，保護H2O2誘導的細胞凋亡，并減少細胞內ROS的產生和線粒體功能障礙[21]，同時槲皮素也可通過介導內皮細胞自噬，促進NO的產生，在高血壓中發揮抗感染、抗氧化應激、保護內皮細胞的作用[22]。山奈酚也叫黃酮醇，研究證實，山奈酚可抑制炎癥因子的表達和高糖誘導的ROS產生[23]。晚期糖基化終產物參與了包括心臟在內的各種器官的糖尿病并發癥的發病機制，而山奈酚可抑制AGEs-RAGE的激活并通過參與維持血流動力學功能，維持氧化劑抗氧化狀態，減少炎癥和細胞凋亡，顯著改善胰島素抵抗誘導的心肌損傷[24]。VEGF通過調節內皮細胞的結構及功能，提高腎小球毛細血管的通透性，促進細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成，從而影響糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)和糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)等微血管并發癥的發展。山奈酚可以通過降低VEGFR-2蛋白水平和激酶活性及其下游信號級聯反應[如PI3K/AKT、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，MEK/ERK)]，觸發VEGF刺激的人臍靜脈內皮細胞中的抗血管生成活性[25]。漢黃芩素也是一種黃酮類化合物，研究表明，漢黃芩素可下調脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的TNF-α和IL-1β表達，并減少其釋放以降低神經細胞毒性，同時抑制 MCP-1在人體內的表達，從而減緩DN進行性腎小管間質病變和腎臟炎癥，其潛在機制可能是通過抑制NF-κB和轉化生長因子-β1/Smad蛋白3(transforming growth factor-beta1/Smad protein3，TGF-β1/Smad3)信號通路來改善DN中的腎臟炎癥和纖維化[26]。此外，通過抑制PI3K/AKT/NF-κB通路可有效抑制高糖誘導的炎癥反應和自噬功能障礙[27]。漢黃芩素還可通過干擾細胞外Ca2+流入和內質網釋放Ca2+的能力，誘導內皮非依賴性血管舒張[28]。研究表明，β-谷甾醇-3-O-D-吡喃葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-D-glucopyranoside，BSD)具有雌激素活性，增強了PI3K介導的骨骼肌細胞中葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)的易位，刺激骨骼肌細胞中的葡萄糖利用[29]。高脂飲食喂養的大鼠給予β-谷甾醇后，可通過增加NO水平促進胰島素敏感性，并且還通過降低肝臟中的氧化、亞硝化應激和脂質累積而發揮保護作用[30]。

KEGG富集分析結果顯示，AGE-RAGE、TNF、IL-17、MAPK、FoxO、PI3K-AKT等通路與糖尿病合并高血壓高度相關。AGE-RAGE軸與糖尿病血管并發癥的發生密切相關[31]。AGE通過與AGE受體RAGE結合，改變先天性和適應性免疫反應，通過產生促炎細胞因子、ROS和活性氮中間體(reactive nitrogen intermediates，RNI) 在免疫相關細胞中轉導炎癥和纖維化信號，引起血管內皮細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞和腎系膜細胞、內皮細胞、足細胞損傷，最終導致各種組織和器官發生纖維化[32]。胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)受到氧化還原敏感性絲氨酸激酶如JNK和ERK-1的激活，導致其絲氨酸磷酸化，磷酸化的IRS-1通過與PI3K的p85調節亞基結合，誘導PI3K脂質激酶的激活?；罨腜I3K繼續轉換并激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1)，使AKT2磷酸化。AKT是GLUT4由囊泡向細胞膜易位的重要調節劑，當發生胰島素抵抗時，PI3K/AKT通路調控障礙，GLUT4向膜的易位減少，導致外周組織葡萄糖代謝受損和胰島素介導的NO合成減少，這可能是糖尿病內皮功能障礙(以及由此產生高血壓)的主要原因。研究表明，牛膝提取物(achyranthes bidentata extracts，ABE)可通過下調AKT2和GLUT1的mRNA表達，上調絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)及胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，從而激活MAPK信號通路并抑制AKT信號通路，以減少糖酵解[33]。

IL-17蛋白通過增強細胞因子和細胞外蛋白的誘導作用，在調節銀屑病、多發性硬化癥和類風濕性關節炎等慢性疾病中發揮積極作用。IL-17信號通過NF-κB激活炎癥轉錄因子以誘導基因表達并激活MAPK通路(p38、ERK、JNK)[34]。IL-17A可直接誘導β細胞凋亡并局部增加細胞因子和趨化因子，加重胰島炎癥，也可能觸發MIN6β細胞系中iNOSmRNA和iNOS蛋白質表達的上調，并導致NO依賴性毒性。因此，減少IL-17A分泌或阻斷IL-17A與受體相互作用的藥物可能具有治療1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)的功效[35]。IL-17通過正向調節IL-6的表達，增強NF-κB信號激活，從而激活包括TGF-β1及信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在內的腎臟纖維化基因，加重腎損傷[36]。目前，IL-17在高血壓中的作用仍然存在爭議，其中可能引起高血壓的原因是IL-17可上調腎小管中的轉運通道[37]。

FoxO的過度激活與高血糖、高三酰甘油血癥和胰島素抵抗有關。FoxO在代謝活躍的細胞(例如肝細胞和脂肪細胞)中高度表達，調節參與脂肪細胞分化、氧化應激反應、脂質代謝以及在低能量攝入條件下誘導糖異生的基因的轉錄。在饑餓狀態下，FoxO可增加脂肪細胞中ROS水平，決定線粒體抗應激反應基因的轉錄，作為營養傳感器通過核質穿梭響應胰島素信號傳導，是新陳代謝的關鍵調節劑。當細胞在正常條件下生長時，FoxO是不活躍的，這需要通過胰島素和生長因子信號傳導進行負調節，二者通過胰島素受體、胰島素受體底物和PI3K發出信號并激活PDK1和AKT?；罨腁KT可以通過三個保守殘基的磷酸化，進而抑制下游轉錄因子FoxO轉錄活性，導致FoxO的細胞質保留。細胞應激后，特別是當產生高水平的活性氧時，FoxO以相反的方式轉移到細胞核中，并表現出高轉錄活性[38]。研究指出，FoxO6亞型可通過激活NF-κB通路，改善高糖高脂血管內皮細胞的胰島素抵抗[39]。

綜上所述，牛膝-鉤藤藥對可能以槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇為主要核心成分，作用于IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MAPK3等核心靶點，通過參與調控脂質、細胞因子、活性氧活性及炎癥反應等生物過程，介導AGE-RAGE、TNF、IL-17、MAPK、FoxO、PI3K-AKT等關鍵通路，起到治療糖尿病合并高血壓的作用。從微觀作用到宏觀協同，本研究證明了牛膝-鉤藤藥對治療糖尿病合并高血壓多成分、多靶點、多過程的分子機制，為深入研究牛膝-鉤藤藥對治療糖尿病合并高血壓的藥理學機制提供依據。