miR-200b與miR-200c靶向DNA甲基轉移酶對卵巢癌細胞順鉑耐藥性的影響

廖年春， 張瀟迪， 劉 玨

(南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院婦產科，湖南省衡陽市 421001)

卵巢癌是女性生殖系統發病率排名第2的惡性腫瘤，其病死率在婦科腫瘤中排第1位[1]。目前卵巢癌首選治療方案為外科手術和術后以順鉑為基礎的化療，但治療后有約60%的患者會出現臨床復發且5年生存率小于45%，復發的主要原因是患者對順鉑產生了耐藥性[2]。

miRNA是一種普遍存在于真核生物細胞中長度約為18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA[3]。miRNA的異常表達與腫瘤細胞的增殖、生長、侵襲和凋亡密切相關[4]。真核生物中存在3種甲基轉移酶(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)，其中DNMT1主要起維持甲基化的作用,而DNMT3A和DNMT3B主要起形成甲基化的作用[5]。miRNA-200是一個較特殊的miRNA家族,其家族成員在多種腫瘤中參與調控DNA甲基化[6]。本文觀察miR-200b與miR-200c靶向DNA甲基轉移酶對卵巢癌細胞順鉑耐藥性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人卵巢癌細胞株(A2780)和人卵巢癌順鉑耐藥細胞株(A2780/DDP)購于長沙麗欣生物有限公司，1640培養基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于以色列Biological Industries公司，青鏈霉素混合液(100×)、順鉑購于北京Solarbio公司。完全培養基即RPMI-1640培養基(含100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素雙抗)+10%胎牛血清(FBS)。

miR-200b、miR-200c、U6引物序列、miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購于上海生工，miR-200b mimics、miR-200c mimics及陰性對照物轉染試劑購于吉瑪基因，0.25%胰酶購于美國HyClone，lipo2000購于Invitrogen公司，二甲基亞砜(DMSO)購于德國Sigma-Aldrich，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B抗體購于CST公司，GAPDH抗體購于Bioworld公司，鼠二抗及兔二抗購于美國Sigma公司，miRNA提取分離試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，PCR試劑盒購于賽默飛。

1.2 qRT-PCR檢測miR-200b與miR-200c表達量

取對數生長期細胞，棄去原培養液，PBS清洗1～2次，miRNA提取分離試劑盒分別提取A2780、A2780/DDP細胞中總miRNA,采用miRNA第一鏈cDNA合成(莖環法)試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板,用U6作為檢測的內參基因，進行qRT-PCR測定細胞中miR-200b與miR-200c水平。引物序列：miR-200b正向引物序列：5′-GCGCATCTTACTGGGCAGC-3′，反向引物序列：5′-AGTGCAGGG TCCGAGGTATT-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACTCCAAT-3′。miR-200c正向引物序列：5′-GCGCGTCTTACCCAGCAGT-3′，反向引物序列：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACCCAAAC-3′。U6正向引物序列：5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，反向引物序列：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATACGACAAA ATA-3′。PCR擴增條件如下：94 ℃ 30 s 1個循環，隨后94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環。分別計算miR-200b與miR-200c的相對表達量，結果采用2-ΔΔCt方法分析。每孔設置3個平行樣本,每組實驗重復3次。

1.3 細胞轉染及細胞分組

取順鉑耐藥細胞株A2780/DDP于含10%FBS的RPMI-1640培養基中，在5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下傳代培養。將2.0×105個/mL的細胞接種于6孔培養板培養24 h后，在細胞達70%～90%左右按轉染試劑說明書對A2780/DDP細胞株進行miR-200b mimics、miR-200c mimics及陰性對照轉染，分為si-miR-200b組、si-miR-200c組、si-NC組,轉染后放入恒溫細胞培養箱中培養4～6 h后換液。轉染后1～2天處理細胞行后續實驗步驟。

1.4 MTT法檢測細胞IC50值

在6孔板細胞轉染24 h后，取對數生長期細胞,0.25%胰酶消化后移至離心管中,離心收集細胞并加入培養基制成單個細胞懸液。加200 μL細胞接種至96孔板中,使每孔細胞含量為2 000個,每樣品設置7個平行濃度，加入濃度梯度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L DDP 48 h后每孔加5 g/L MTT溶液,孵育4 h，繼而每孔加150 μL DMSO并振蕩5 min。酶標儀在492 nm處測定達到預定時間后的各孔光密度值(OD),用SPSS軟件計算各組細胞IC50值。

1.5 Western blotting法檢測轉染后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平

轉染48 h后取各組細胞，在冰上進行提取蛋白操作，棄去原培養液，4 ℃預冷的PBS溶液洗2～3次，每孔加入蛋白裂解液200 μL(RIPA∶PMSF=100∶1)提取總蛋白，取部分蛋白溶液用于BCA測定蛋白水平，按配方配置8%分離膠，依次進行電泳、轉膜、封閉，封閉2 h后分別加入DNMT1、DNMT3A和DNMT3B(均為兔單抗)蛋白稀釋(1∶1 000)后的一抗，GAPDH作為內參稀釋(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，12 h后，回收一抗，TBST搖床洗去殘留一抗，10 min/次，洗3次，加入稀釋的兔二抗(1∶5 000)，室溫避光孵育2 h，TBST洗去殘留二抗，10 min/次，洗3次，最后顯影。計算DNMTs/GAPDH比值,即表示DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相對表達水平。每組實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

各組細胞加入DDP室溫孵育48 h，隨后加入Annexin V-PE結合液混勻,避光室溫孵育15 min。采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.7 統計學方法

應用SPSS25.0統計軟件分析，組間比較采用方差分析及t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。應用Graph Pad Prism8統計繪圖。

2 結 果

2.1 A2780和A2780/DDP中miR-200b與miR-200c的表達情況

miR-200b與miR-200c在A2780細胞株的表達量均明顯高于A2780/DDP細胞株(P<0.05；圖1)。

圖1 A2780和A2780/DDP細胞株中miR-200b與miR-200c的表達量

2.2 轉染后各組細胞IC50值情況

si-miR-200b組、si-miR-200c組IC50值明顯低于si-NC組(P<0.05；圖2)。

圖2 A2780/DDP細胞株中各組IC50值比較

2.3 轉染后各組細胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平情況

si-miR-200b組、si-miR-200c組DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達水平低于si-NC組(P<0.05；圖3)。

圖3 A2780/DDP細胞株轉染后各組細胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的相對表達量

2.4 轉染后各組細胞凋亡率情況

轉染后A2780/DDP細胞株的各組細胞隨順鉑濃度的增加，凋亡率逐漸增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。在相同濃度藥物處理下，si-miR-200b組、si-miR-200c組凋亡率高于si-NC組(P<0.05)，而si-miR-200b組、si-miR-200c組無統計學意義(P>0.05；圖4)。

圖4 轉染后各組細胞凋亡率的比較

3 討 論

卵巢癌為婦科三大腫瘤之一，其治療手段一直是研究熱點，近幾年的治療手段也取得了不錯的成果，但術后的順鉑耐藥仍然是影響卵巢癌患者術后生存率的重要問題[7]。

miRNA直接或間接調節涉及藥物代謝、藥物運輸、藥物靶標和下游信號分子的基因的表達[8]。越來越多的研究表明，miRNA可以調節藥物代謝酶和轉運蛋白基因表達,改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，從而影響治療效果[8-10]。Lee等[11]發現，miR-200家族在EEC中高表達，并可能在癌癥生長中發揮重要作用，用抗miR-429轉染可以增強EEC中順鉑的細胞毒活性。Sun等[12]發現，miR200家族可能通過ZEB1/pSMAD3下調MMP3，從而抑制了卵巢癌細胞的侵襲和轉移。Lynch等[13]發現，miR-200c和miR-141在前列腺癌中的異常表達可能作為前列腺癌的診斷和預后方面的新型生物標志物或治療干預的重點。本文實驗通過qRT-PCR技術發現在人卵巢癌細胞株A2780中，miR-200b、miR-200c的表達均明顯高于人卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/DDP，通過細胞轉染技術用miR-200b、miR-200c的模擬物對A2780/DDP細胞株進行轉染，發現miR-200b、miR-200c能增強A2780/DDP細胞對順鉑藥物的敏感性并增加A2780/DDP細胞的凋亡，表明miR-200b、miR-200c能增加卵巢癌細胞對順鉑藥物的敏感性并逆轉耐藥細胞的耐藥性。

近年來表觀遺傳學備受關注，主要包括異常DNA甲基化、組蛋白修飾表達譜以及非編碼RNA表達等[9]。表觀遺傳改變可通過調節參與藥物代謝和分布以及藥物靶標的關鍵基因的表達來影響藥物治療，從而導致藥物反應的個體差異。這些表觀遺傳學改變以及循環核酸的表觀遺傳學特征的發現，對藥物治療療效的改變，甚至為個性化治療提供生物標志物，特別是在癌癥的治療中[10]，具有不可忽視的潛力。DDNMT通常在各種癌癥組織和細胞系中過表達。DNA甲基化是可逆的，因此DNMT是藥物開發的重要表觀遺傳學靶標[14]。DNA高甲基化可能是獲得對順鉑耐藥性的分子機制之一[15]。癌癥甲基化組中的多個DNA甲基化變化與耐藥性的獲得有關[15]。在耐順鉑的卵巢癌中觀察到DNA甲基轉移酶的顯著上調[16]。本實驗通過增加A2780/DDP細胞的miR-200b、miR-200c表達可顯著抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達量。

本研究結果表明，增加miR-200b與miR-200c的表達可抑制DNA甲基酶的表達，增強順鉑耐藥細胞A2780/DDP對DDP的靈敏度，增加卵巢癌細胞的凋亡，逆轉耐藥細胞株的耐藥性。