藻菌生物膜對廢水Cu2+吸附及其胞外聚合物變化研究

任蕓蕓，胡文杰，張 莎

(1.銅川職業技術學院，陜西 銅川 727031；2.橫河電機（中國）有限公司，陜西 西安 710075；3.陜西科技大學，陜西 西安 710021)

0 引言

我國工業發展迅猛，對于原材料及產品生產能力的需求日益增多，而由此產生的資源開采和后續產業排放引起的環境問題也愈發嚴重，其中重金屬污染由于毒性強、存在期長最引人擔憂[1]。Cu 作為典型的重金屬污染物，由于其使用范圍廣泛，成為了最嚴重的重金屬污染之一[2]。 雖然微量Cu 是生物體生長發育的必須元素，但濃度過高時將會引起生物體代謝紊亂并進而形成毒害作用[3]，并通過水流沖刷以及隨水流向下滲透等方式進入地球的水循環，并最終通過生物鏈超量累積于生物體內，對生物體造成長期毒害作用[4]。 因此，近年來對Cu 污染水體的有效處理已經逐漸引起關注。

重金屬污染水體的修復的方法主要有3 類：物理、化學及生物修復法。 其中，生物修復法由于修復成本低、 環境友好性強以及無二次污染等優點而受到廣泛關注[5]。 CHOI Y S 等[6]研究利用蚯蚓處理含Cu 和Hg 的泥土，結果表明處理后污泥中的Cu 含量降低了23.86%。 楊世勇等[7]研究發現高山甘薯可以有效富集Cu，富集量可達12 300 mg/kg。 李影等[8]研究了蕨類草本植物對Cu 的富集作用，結果表明節節草和蜈蚣草分別具有耐性強和生物量大的優點，是Cu 污染修復的理想植物。 近年來興起的重金屬藻類修復技術逐漸被寄予厚望[9-10]，其對比一般植物修復及微生物修復技術，更具有繁殖快、易回收及吸附量大等優點。 馬艷等[11]利用藻菌生物膜處理鉛鋅尾礦渣中的重金屬，結果表明，藻菌生物膜可以通過胞外聚合物 （EPS） 與重金屬的絡合來吸附重金屬，其中對Pb2+的吸附能力最強。目前的研究已證明了藻類及藻菌生物膜對部分重金屬具有良好的去除效果。研究擬利用城市自然水體，通過富集培養及掛膜制備藻菌生物膜，并對含Cu2+模擬廢水進行處理，以驗證藻菌生物膜對Cu2+的吸附效果及其胞外聚合物的變化，可為Cu 污染水體的生物修復提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藻菌富集培養及掛膜所使用原始水樣取自西安市長樂公園芙蓉湖。

1.2 實驗設置

過高濃度的重金屬將對微生物產生脅迫毒害作用，因此在研究中一般設計ρ（Cu2+）為0.5～30 mg/L[12-13]。 各因素對Cu2+吸附影響的實驗設置如下：

（1）pH 值

模擬廢水ρ（Cu2+）為1 mg/L，室溫，pH 值分別為：3，4，5，6，7，8，9，共7 個梯度，處理第2 天取樣檢測Cu2+濃度；

（2）溫度

模擬廢水ρ （Cu2+） 為1 mg/L，溫度分別為：25，30，35，40，45 ℃，共5 個梯度，處理第2 天取樣檢測Cu2+濃度；

（3）初始濃度

模擬廢水ρ（Cu2+）初始分別為1，5，10，15，20 mg/L，共5 個梯度，室溫，處理第3 天取樣檢測Cu2+濃度、多聚糖及ATP 含量；

（4）吸附時間

模擬廢水ρ（Cu2+）為1mg/L，室溫，在運行前取樣，并在之后每隔1 d 取樣檢測Cu2+濃度、多聚糖及ATP 含量。 并設置ρ（Cu2+）=0 mg/L 為空白對照組。

上述實驗中每個處理設置3 個重復組；

（5）連續吸附實驗

模擬廢水ρ（Cu2+）為16 mg/L，反應器有效容積為16 L，其中含有6 串掛好膜的填料，利用蠕動泵連續進水及出水，流速為50 mL/h，室溫，每隔1 d 取樣檢測Cu2+濃度，實驗裝置見圖1。

圖1 含Cu2+廢水連續處理裝置示意

1.3 實驗流程

（1）藻菌富集培養及掛膜

取回一定量水樣后，在容積為20 L 的有機玻璃圓桶中進行培養。 培養條件為：自然光照下室溫（夏季）培養，用空壓機進行曝氣，同時加入16 L 滅菌后的液體培養基供培養生物膜用（培養基成分：每升培養基包含滅菌米湯水100 mL，Ca(NO3)2·4H2O 0.25 g；NaCl 0.3 g； MgSO4·7H2O 0.05 g；KH2PO40.05 g；ZnSO4·7H2O 0.05 g；NaHCO30.02 g；FeCL3，MnCl2，Na2MoO·H2O，CuSO4·5H2O 痕量），之后每10 d 加1次培養基至原水位線。 培養1 個月后用半軟性填料掛膜15 d，得到藻菌生物膜備用。

（2）藻類鑒別

用壓滴法[14]制作藻類的標本片，通過顯微鏡（CX41RF，奧林帕斯有限公司）放大1 000 倍觀察。為便于采集生物膜樣品，每片填料上平行懸置2 片載玻片。 載玻片使用前經洗滌劑浸泡24 h 后用去離子水清洗再放入質量分數為15%的硝酸溶液中浸泡24 h，重復2 次后用去離子水洗凈。

（3）Cu2+濃度設置

使用CuSO4·5H2O（分析純）配置質量濃度為1 000 mg/L 的濃縮液，然后在500 mL 培養所得菌液中加入相應量的濃縮液得到不同初始濃度的溶液。使用NaOH（分析純）和HCl（分析純）調節pH 值，采用pH 計（PHS-3C,北京普析通用儀器有限公司）測定pH 值，使用水浴加熱鍋調節運行溫度。 開始運行時各處理組加入1 片掛好膜且長勢相似的藻菌生物膜；

（4）Cu2+濃度及胞外聚合物含量測定

從反應器中取100 mL 水樣，用鑷子刮取載玻片上約2 cm3生物膜，一同放入離心機中在6 000 r/min轉速，20 ℃條件下離心10 min，取上清液測水樣中Cu2+濃度，并將離心后的生物膜分成2 份，分別稱量重量并測定生物膜中多聚糖和ATP 含量。

1.4 檢測方法

（1）Cu2+濃度測定采用火焰法[15]。取100 mL 水樣放入150 mL 錐形燒杯中，加入硝酸5 mL，在電熱板上加熱消解（不要沸騰），蒸至10 mL 左右，再加入5 mL HNO3，2 mL HClO4，繼續消解至1 mL 左右，取下冷卻，并加水稀釋至100 mL，過濾后用原子吸收光譜儀（AnaLyst 800，Perkin ELmer）測定其濃度。 同時做空白樣；

（2）多聚糖的測定采用苯酚-硫酸法測定[16]。 將離心后的1 份生物膜放入10 mL 試管中加入1 mL去離子水并充分混合，加入質量分數為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻后迅速加入5 mL 質量分數為95%的H2SO4在黑暗環境中反應10 min，反應結束后，再震蕩10 s，最后將試管置于30 ℃水浴中10 min 后，使用紫外分光光度計（Tu-1901，肇慶市高能達化工有限公司）在490 nm 處比色測定吸光度，并根據標曲得出多聚糖濃度；

（3）ATP 的測定采用間接測定法[17]。 將離心后的1 份生物膜加入裝有1 mL 去離子水的試管中，完全混合后加入2.5 mL 質量分數為95%的H2SO4，然后用紗布蓋上、封嚴，置于溫度128 ℃高壓鍋加壓15 min 后取出，室溫下冷卻后，加1～2 滴質量分數為30%的H2O2溶液，搖勻，用2 mL 去離子水稀釋，然后再給各管加定磷試劑3 mL，置于45 ℃水浴25 min，取出冷卻至室溫，在紫外分光光度計660 nm 處比色測定，并根據標準曲線得出ATP 濃度。

1.5 數據處理

利用DPS 7.5 進行數據分析；Origin Pro 8.5 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 藻菌生物膜的培養及鑒別

藻菌微生物的富集過程及后續掛膜過程見圖2。

圖2 藻菌生物膜圖像

由圖2（a）可以看出，藻菌微生物在富集30 d 后培養液顏色明顯加深，說明微生物富集濃度顯著提升，并通過軟性填料成功掛膜，得到長勢良好的藻菌微生物掛膜片。由圖2（b）可以看出，通過1 000 倍放大顯微鏡對培養液中的微生物進行鑒定，發現此類微生物細胞呈現為橢圓形或球形，顏色表現為淡綠色，整體為無一定數目的群體或單細胞。 與《微生物的鑒別與圖譜》 進行對比確認此類微生物符合綠藻門小球藻屬微生物的典型特征。

2.2 不同處理參數對生物膜處理含Cu2+廢水效果的影響

不同處理參數下藻菌微生物對含Cu2+模擬廢水的處理效果見圖3。

圖3 各處理參數對生物膜處理含Cu2+廢水效果的影響

由圖3（a）可以看出，在Cu2+初始濃度為1 mg/L、溫度為35 ℃條件下處理1 d，藻菌微生物對Cu2+的吸附效率隨pH 值增加先升高后降低，在pH 值為5時達到最佳，吸附量為0.183 7 mg，去除率為36.73%，后續逐漸降低。 整體而言，酸性環境下的處理效果優于堿性條件；

由圖3（b）可以看出，pH 值為7，微生物在35 ℃時具有最佳的處理效果，Cu2+吸附量為0.175 0 mg，去除率為34.99%； 當溫度超過40 ℃后，微生物對Cu2+的吸附效率較低溫時明顯下降；

由圖3（c）可以看出，當初始質量濃度不超過15 mg/L 時，微生物對Cu2+的吸附效率隨初始質量濃度的升高而升高，在15 mg/L 時，吸附量達到最高，為2.565 8 mg；但當質量濃度超過15 mg/L 時，吸附效率明顯下降；

由圖3（d）可以看出，吸附效果隨時間增加而升高，處理1 d 時Cu2+吸附最快，Cu2+濃度明顯降低，Cu2+吸附量和去除率分別為2.303 mg 和57.59%，之后吸附量增速減緩，6 d 后分別為2.877 2 mg 和71.93%，此時模擬廢液中ρ（Cu2+）為0.280 7 mg/L。

2.3 生物膜處理含Cu2+廢水的動力學及擬合

對含Cu2+廢水的動態處理過程進行動力學擬合，所采用的動力學模型方程及擬合參數見表1，擬合結果見圖4。 一級動力學模型和二級動力學模型都能較好的驗證數據，表明藻菌微生物膜可在3 d內較高效的處理含Cu2+廢水。

表1 生物膜處理含Cu2+廢水動力學擬合及參數

圖4 生物膜處理含Cu2+廢水的動力學擬合

2.4 含Cu2+廢水對生物膜胞外聚合物的影響

處理含Cu2+廢水的過程中，藻菌生物膜的胞外聚合物的變化見圖5。

圖5 藻菌生物膜的胞外聚合物的變化

由圖5（a）可以看出，含Cu2+廢水中的藻菌生物膜所具有的多聚糖含量相較空白水樣明顯增加，且隨著處理時間增加，前者升高的幅度明顯大于后者，在含Cu2+廢水中處理至第4 天時，藻菌生物膜多聚糖含量達到最高，為1.915 mg/（mL·g），之后有所下降。

由圖5（b）可以看出，藻菌微生物ATP 含量變化與多聚糖有所不同，含Cu2+廢水中的藻菌微生物ATP 含量明顯低于空白水樣中。 且與空白水樣中ATP 含量持續上升不同的是，含Cu2+廢水中的藻菌微生物ATP 先降后升再下降，并在第4 天達到最高，為7.02 mg/（mL·g）。

由圖5（c）可以看出，Cu2+初始濃度的增加將導致藻菌微生物多聚糖和ATP 含量持續下降。 分別由ρ（Cu2+）為1 mg/L 時的1.632 mg/（mL·g）和5.21 mg/（mL·g），下降至ρ（Cu2+）為20 mg/L 時的1.029 mg/（mL·g）和1.75 mg/（mL·g）。

綜上所述，藻菌生物膜的胞外聚合物含量隨處理時間增加而整體呈現升高的趨勢，但隨著Cu2+初始濃度的增加而表現出下降的趨勢。

2.5 連續吸附含Cu2+廢水試驗

藻菌生物對含Cu2+廢水進行連續吸附處理的出水效果見圖6。

圖6 連續吸附處理過程中出水Cu2+濃度變化

由圖6 可以看出，在前10 d 內，出水Cu2+濃度受培養液稀釋明顯，出水濃度上升明顯且波動較大，出水質量濃度從第1 天的0.205 mg/L 逐漸上升至第9 天的0.561 mg/L。 處理20 d 后，液體置換過程幾乎完成，稀釋效果降低，出水Cu2+濃度上升變緩慢且更穩定，ρ（Cu2+）從第20 天的0.523 mg/L 逐漸上升至第42 天的0.689 mg/L，并維持在該水平，此時Cu2+去除率約為95%。

3 討論

微生物對重金屬的去除效果受處理條件及參數的影響十分明顯，處理參數及條件不僅影響微生物自身的代謝過程[18]，也影響著微生物重金屬與重金屬的結合過程[19]。 已經有研究證明，藻類對于重金屬的吸附依賴于其細胞表面的自由位點數目，而自由位點數目受pH 值影響明顯[20]。 當pH 值為5 時，藻菌微生物對Cu2+的去除率達到最高，當pH 值＞8時，其去除率迅速下降。 這是由于在低pH 值的情況下，pH 值的上升會引起細胞壁上的胺基、 酰基胺和羥基等表面官能團質子化減少，溶液中正電荷與Cu2+的競爭減弱，吸附量得以提升。但較高pH 值下，溶液中的金屬離子又多以氫氧化物的形式存在，剩余Cu2+由于具有較強的電子結合能力而容易被周圍陰離子包圍，形成帶負電的基團，從而顯著降低藻類對水中銅離子的去除效果；另一方面，過高或過低的pH 值對微生物自身代謝的不利影響也決定了其不佳的吸附性能[21]。

微生物對環境溫度較為敏感，合適的溫度有利于其自身的代謝過程，并進一步影響其對重金屬的吸附[22]。 本實驗的結果表明，藻菌生物膜處理含Cu2+廢水的最佳溫度為30～40 ℃，在此溫度區間內，微生物可以維持較高的活性，有利于吸附的進行。 一方面，當溫度過高，微生物體內代謝物質發生不可逆的損傷，因此使其吸附Cu2+能力降低；另一方面，Cu2+在生物膜表面的吸附屬于放熱反應[23]，這也是溫度升高，吸附量增加的原因之一。 但整體來看，微生物代謝對溫度的敏感性才是影響其重金屬吸附的主要因素。

藻菌生物膜對Cu2+的吸附量及去除率與溶液初始Cu2+濃度強烈相關。 在多數以微生物作為吸附劑的研究中[24]，都表現為隨著溶液初始重金屬濃度升高，吸附量先升高后下降，而去除率則持續下降。 這是由于在微生物對重金屬的容忍范圍內，重金屬的濃度增加將提升結合位點吸附重金屬的概率。 但當初始初始濃度超過微生物的容忍范圍，微生物受到強烈的毒害作用而消亡，而作為抗脅迫作用而分泌的胞外聚合物也將急劇減少[25]。 同時，DLVO 理論[26]也提出，在合適的重金屬濃度范圍內，絮凝能力也會隨離子強度的增加而加強，有利于重金屬吸附，而在過高的濃度下則會產生重金屬抗凝作用，減弱重金屬的吸附。

對藻菌生物膜處理含Cu2+廢水不同時間的研究表明了生物膜在24 h 內即可快速吸附Cu2+，并在后續6 d 內繼續緩慢吸附。 同時，生物膜在Cu2+脅迫下得響應機制也可以從其胞外聚合物的變化趨勢中觀察到。 與無脅迫下對比發現，Cu2+脅迫下得生物膜多聚糖含量明顯較高，而ATP 含量則明顯較低，且脅迫下得多聚糖和ATP 含量都在4 d 內上升到最高點，后續緩慢下降。 這說明了Cu2+脅迫下，藻菌生物膜的受重金屬毒性而生理活性較低，ATP 含量減少，此時，生物膜啟動自身響應機制，分泌更多的多聚糖來抵抗重金屬的毒性脅迫。 后續隨著生物膜自身響應抵抗脅迫過程的進行，4 d 后ATP 含量逐漸回歸正常水平范圍，多聚糖的分泌活動也由頂峰逐漸減弱。有諸多研究已經證明，大多數植物及微生物都具有類似的協調響應抗脅迫機制來應對生存環境中的不利因素[27]。

4 結論

生物修復法由于其成本低廉、 環境友好性強等優點已成為當下重金屬處理領域的熱點。 本研究探究了通過城市湖水中藻類富集掛膜得到藻菌生物膜對含銅廢水的處理效果，發現在溫度為35 ℃，pH 值為5 時生物膜對含Cu2+廢水處理效果最佳，生物膜最大Cu2+耐受質量濃度為15 mg/L，并在24 h 時可近似達到吸附平衡。 探究了生物膜連續處理含Cu2+廢水，發現其具有良好的穩定性，處理50 d 時對Cu2+的去除率仍可達95%，，藻菌生物膜在含銅廢水處理中具有良好的應用前景。