不同城市PM2.5致小鼠肝臟纖維化的效應差異研究

閆志鵬,李舒月,邢頎頌,南 楠,秦國華,桑 楠

不同城市PM2.5致小鼠肝臟纖維化的效應差異研究

閆志鵬,李舒月,邢頎頌,南 楠,秦國華*,桑 楠

(山西大學環境與資源學院,山西 太原 030006)

為闡明PM2.5誘發肝臟纖維化的潛在機制以及導致這種不良效應的主要組分,本研究以采自我國太原、北京、杭州和廣州市的PM2.5暴露10月齡C57BL/6雌性小鼠4周后,利用組織切片染色,熒光定量PCR(qRT-PCR)以及Western blot 技術檢測小鼠肝臟纖維化的發生,并采用皮爾森相關系數法分析不同城市PM2.5暴露組小鼠肝臟纖維化相關基因表達水平與各城市典型化學組分的線性相關關系.結果發現,與對照組相比,太原組和杭州組小鼠肝臟臟器系數顯著降低;太原組小鼠肝臟膠原沉積面積顯著增加,肝臟纖維化相關基因(和)的轉錄水平顯著升高,并且也僅有太原組PM2.5暴露誘導了小鼠肝臟蛋白的顯著增高,而其他城市PM2.5暴露組并未見上述纖維化相關因子的顯著變化.相關性分析結果顯示,Cr、Mn、Mo、Cs、Pb、Bi、U和Fe等金屬組分與和Col3a1的mRNA表達呈顯著正相關,除NA、AC及BaP外其余15種多環芳烴均與表達顯著相關,18種PAHs之和與表達顯著相關.上述結果表明,PM2.5暴露可導致小鼠肝臟纖維化的發生,其中太原市PM2.5誘導肝臟纖維化發生最為顯著,TGF-β及其通路中相關信號分子在介導PM2.5誘發肝臟纖維化發生中發揮了重要作用,Cr、Mn、Mo、Cs、Pb、Bi、U、Fe及PAHs很可能是細顆粒物暴露導致小鼠肝臟纖維化的關鍵毒性組分.

PM2.5；肝臟；纖維化；關鍵組分

據世界衛生組織(WHO)統計,全世界每年因PM2.5暴露導致的過早死亡人數約為300萬[1-2].此外,PM2.5暴露還與心肺疾病、腦血管疾病和肺癌等疾病的發病率增加有關[3].統計數據表明截至目前仍有超過80%的人生活在空氣質量標準超過WHO限值的地區[4].但是,WHO及大多數國家環境部門在制定空氣污染物限值標準時,通常是假定單位質量濃度的毒性強度相等,基于風險估算值(每μg/m3)來估算大氣PM2.5暴露對人口健康的影響,然而,近年來流行病學與毒理學研究均發現在不同地域暴露于相同質量濃度的PM2.5可能導致程度不一的健康后果[5].由此可見,PM2.5污染仍是目前全球范圍內一個嚴重的公共衛生問題,研究PM2.5對于人體暴露的區域毒性差異具有重要意義.

越來越多的流行病學證據表明,PM2.5污染可能是導致全球肝損傷(包括非酒精性脂肪肝、肝纖維化和肝癌等)和代謝綜合征發病率上升的最重要環境因素之一[6-7].肝纖維化是多種肝病的常見病理過程,其特征是肝臟正常組織結構中膠原纖維過量積聚、肝臟組織中膠原濃度顯著升高或膠原成分發生改變[8].基于實驗動物模型的研究發現,不論是在美國哥倫布還是我國新鄉市,吸入高濃度環境PM2.5均可誘導小鼠肝組織纖維化,并且高脂飲食加重了這種不良反應[9-10].現有研究認為,外源物質通過激活轉化生長因子β()信號,促進磷酸化,進而促進、合成,增加膠原蛋白和的表達是肝臟纖維化發生的一條經典通路[8],但TGF-β及其通路中相關信號分子是否介導PM2.5誘發肝臟纖維化發生及機制鮮見報道.

雖然來自不同地區的研究均發現PM2.5可導致動物肝臟膠原沉積增加/纖維化,然而這些不良影響和危害程度不同[9-10],另有研究顯示,國外不同區域內PM2.5濃度升高相同值對肝臟疾病發病率的風險各異[11].我國首個研究PM2.5長期暴露與NAFLD風險關聯的前瞻性隊列結果表明:同一地區生活在離交通主干道地區越近的人群,肝臟脂肪累積越明顯,NAFLD發病率越高[12].造成上述差異的根本原因可能與PM2.5所負載的化學成分和來源有關[12].目前文獻關于PM2.5導致肝臟纖維化的發生雖有報道,對不同地區PM2.5樣本中的重要毒性組分的研究也多有測定,然而某些毒性組分在細顆粒物中所占比例高并不意味著其對整體復合毒性的貢獻大,針對PM2.5中究竟是哪些組分可誘導肝臟纖維化還不清楚.

為此,本研究通過采集我國重點監控的京津冀及周邊地區、長江三角洲和珠江三角洲等大氣污染防治重點區域的四個城市(太原,北京,杭州和廣州)PM2.5樣本,將其暴露于10月齡雌性小鼠,以肝臟纖維化標志物的表達變化為效應終點,同PM2.5中典型化學組分進行統計學關聯,初步判定PM2.5中可能誘導肝臟纖維化的主要毒性組分,以期為大氣污染的風險評估和防治提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

雌性C57BL/6 小鼠購于南京君科生物工程有限公司;總RNA提取試劑Trizol,反轉錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均購于Takara公司;引物由上海Invirtrogen有限公司合成;10%的中性甲醛溶液購于武漢賽維爾生物科技有限公司.

1.2 PM2.5樣本采集與染毒液制備

采用TH-150CⅢ型中流量大氣采樣器于2017年11月至2018年1月同時在我國四個城市采集大氣中的PM2.5.采樣點分別設在太原(山西大學),北京(國家納米科學技術中心),杭州(浙江工業大學)和廣州(中山大學).采樣流量設定為100L/min,采樣時間設定為22h/d,將PM2.5收集在石英濾膜上.采集完成后,將整個采樣期間獲得的石英濾膜剪碎浸泡在超純水中,經超聲振蕩、紗布過濾掉大塊殘渣后制成PM2.5懸濁液,然后將其真空冷凍干燥為PM2.5干粉.暴露小鼠前稱取一定量的PM2.5干粉, 用生理鹽水配制成等質量濃度的PM2.5懸濁液.所采集PM2.5的典型化學組分(金屬和多環芳烴)信息參見本課題組前期文獻[13].

1.3 小鼠分組、染毒與取材

選10月齡SPF級雌性C57BL/6小鼠45只,適應性喂養1周后按體重隨機分為對照、太原、北京、杭州、廣州5組,每組9只.參考課題組前期染毒劑量[14],采用咽后壁滴注法給不同城市組小鼠滴注3mg/kg(以體重(BW)計)的PM2.5懸濁液,對照組小鼠滴注等量生理鹽水,隔天滴注一次,持續染毒4 周.實驗期間觀察小鼠的精神狀況, 日常行為以及體重變化等情況.

PM2.5持續暴露4周后處死小鼠,快速摘取小鼠肝臟,生理鹽水漂洗、拭干組織表面浮水后稱重.取肝臟大葉邊緣組織用10%的中性甲醛溶液固定,剩余組織用液氮速凍后轉入-80℃冰箱凍存.

1.4 組織切片的制備、染色與觀察

取10%中性甲醛固定的肝臟組織,制備常規石蠟切片,采用蘇木素-伊紅(H&E) 和Masson三色法染色,顯微鏡觀察并拍照,并使用 Image-Pro Plus軟件計算膠原沉積(藍色)面積占總面積百分比,定量表征肝纖維化程度[15].

1.5 總RNA提取及實時熒光定量PCR

采用Trizol提取小鼠肝臟組織總RNA.使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA,參照試劑說明建立qRT-PCR反應體系檢測目的基因的表達.使用梯度稀釋的cDNA為模板做每個基因的標準曲線,得到每個樣品的目的基因及內參基因GAPDH的相對數值,先計算每個樣品的目的基因/內參基因GAPDH的比值,再計算各處理組與對照組之間目的基因/內參基因比值的比值[15].引物序列見表1.

表1 實時熒光定量PCR中所用引物序列

1.6 蛋白免疫印跡分析(Western-blot)

用預冷蛋白裂解液從肝臟中提取蛋白質,經 SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜等步驟將目的蛋白電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,隨后經封閉、一抗孵育、二抗孵育、蛋白顯影等步驟對目的蛋白的表達進行定量檢測[15].目的蛋白與β-actin光密度比值即為目的蛋白的相對表達含量.

1.7 數據統計與分析

本研究中數據均以平均值±標準誤表示.實驗結果采用單因素方差分析,組間比較采用LSD法.用皮爾森相關系數(Pearson)法分析目的基因轉錄水平變化與PM2.5典型化學組分質量濃度的相關性[13].< 0.05,用*表示,<0.01,用**表示.

2 結果與分析

2.1 不同城市PM2.5暴露對小鼠一般體征和肝臟系數的影響

實驗期間各組小鼠行為活動無明顯異常,飲食與排便正常,生長狀態良好,無死亡.本課題組前期報道顯示,經不同城市PM2.5暴露后各組小鼠間體重無顯著差異[16].取肝臟組織稱重并計算臟器系數發現,與對照組相比,太原組和杭州組小鼠肝臟臟器系數顯著降低,而北京組和廣州組則無顯著變化(圖1).該結果提示太原市和杭州市PM2.5暴露可能對小鼠肝臟產生了一定的毒性作用,引發實驗動物的肝臟萎縮.

圖1 不同城市PM2.5暴露對對小鼠肝臟系數的影響

2.2 不同城市PM2.5暴露對小鼠肝臟組織病理變化的影響

圖2 不同城市PM2.5暴露對小鼠肝臟組織病理變化的影響

采用H&E染色法觀察不同城市PM2.5暴露對小鼠肝臟組織學的改變,結果顯示,對照組小鼠肝臟組織結構正常,肝細胞以中央靜脈為中心呈輻射狀有序分布;太原組小鼠肝臟雖然也以中央靜脈為中心呈輻射狀分布,但匯管區結構不明顯,疑似靜脈管周有膠原纖維散在.北京組和杭州組小鼠肝組織未呈明顯異常病理變化.而廣州組小鼠可見輕度炎性細胞浸潤(黃色箭頭)、肝細胞空泡化和肝索紊亂(圖2).

圖3 Masson染色膠原沉積面積量化結果

對肝臟進行Masson染色通過評估膠原沉積表征小鼠肝臟的纖維化程度.如圖2顯示,對照組小鼠的膠原分布正常且很少,北京組、杭州組和廣州組小鼠肝組織膠原沉積也不明顯,僅有太原組肝組織存在廣泛的膠原沉積(黑色箭頭,中央靜脈周圍藍色視野).纖維化區域的定量結果(圖3)顯示,太原組小鼠肝臟膠原沉積比例達對照組的2.62倍,提示太原市PM2.5可引起肝臟膠原沉積與纖維化反應.

2.3 不同城市PM2.5暴露對小鼠肝臟纖維化相關基因轉錄水平和蛋白表達的影響

對肝臟中的主要結構膠原蛋白和,促纖維化標志物以及纖維化相關基因的mRNA 水平進行檢測,結果顯示:太原組小鼠肝臟中、、和的mRNA水平均顯著高于對照組(<0.05),變化倍數分別為2.64、2.37、1.49和2.24,而北京、杭州和廣州組小鼠肝臟中上述4種基因的表達無明顯變化(圖4).基于上述結果,我們進一步比較了轉錄水平變化最明顯的基因在小鼠肝臟中蛋白表達水平,發現僅有太原組PM2.5暴露誘導了小鼠肝臟I型膠原蛋白的表達上升(圖5),這些表明太原市PM2.5可誘導小鼠肝組織中纖維化相關因子的轉錄與表達水平的顯著上升,導致小鼠肝臟纖維化發生.

圖4 不同城市PM2.5暴露對小鼠肝臟纖維化相關基因轉錄水平的影響

2.4 PM2.5中典型化學組分與小鼠肝臟纖維化相關基因轉錄水平的關聯分析

3 討論

已有大量研究證實了PM2.5暴露對人群呼吸系統、循環系統等的健康危害.肝臟作為重要的代謝和解毒器官,也易受到外來物質的影響.肝纖維化是一種肝臟應對外來有毒物質脅迫而產生的可逆性傷口愈合反應[17],肝內結締組織增生與沉積以及纖維瘢痕的形成是肝纖維化的典型表現[18-19].據報道,PM2.5是誘發肝纖維化的重要危險因素,暴露于PM2.5的動物可觀察到肝組織學有明顯的竇周纖維化,肝纖維化標志物表達明顯上調[9]等病理現象.但由于地形特征、氣象條件以及污染排放源的不同,不同來源、時空范圍的PM2.5毒性存在著巨大的差異.為此,我們采集我國重點監控的京津冀及周邊地區、長江三角洲和珠江三角洲等大氣污染防治重點區域的四個城市的PM2.5樣本,在測定其典型化學組分的基礎上,探討其對小鼠肝臟纖維化的效應差異原因,為初步判定PM2.5中可能誘導肝臟纖維化的主要毒性組分提供數據支撐.

PM2.5暴露引起小鼠肝臟的臟器系數和病理學改變存在城市差異性.臟器系數可能是體現某些受試物毒性的敏感指標,石蠟切片H&E染色是檢查器官形態結構變化的最常用方式.本研究發現,太原市PM2.5處理組小鼠和杭州市PM2.5處理組小鼠肝臟臟器系數顯著降低,提示小鼠肝臟已發生一定的病變,但通過組織切片觀察、分子生物學檢測發現僅太原市PM2.5誘導了小鼠明顯的肝臟纖維化,杭州市PM2.5并沒有產生類似的效應.此外,H&E染色發現僅有廣州組小鼠肝臟存在輕度炎性細胞浸潤、細胞空泡化等病理特征.本課題組前期研究發現,太原市PM2.5中重金屬和多環芳烴組分濃度遠遠高于廣州市和杭州市,且太原市PM2.5對小鼠心臟功能、心肌肥大等方面的影響較其他城市來說較大[20],而廣州市PM2.5誘發小鼠肝臟脂肪變性效應發生的能力最強(數據未發表);杭州市PM2.5處理組小鼠肝臟系數的降低表明杭州市PM2.5對小鼠肝臟存在明顯的毒性效應,但毒理終點尚未明確.因此我們認為,PM2.5各組分間相互關系的復雜性以及生物體對不同毒性組分組合的敏感性是造成PM2.5生物毒性的差異性的根本原因,太原市PM2.5暴露組小鼠肝臟系數顯著下降以及出現明顯的纖維化表型可能與PM2.5所含成分有著直接關系.

PM2.5暴露引起小鼠肝臟纖維化相關基因表達改變存在城市差異性.研究表明,肝臟纖維化是一個涉及肝臟巨噬細胞(Kupffer細胞)、肝貯脂細胞(Ito細胞)、肝星狀細胞(HSC細胞)以及細胞外基質等多種特殊細胞類型協調作用的復雜過程[21].當肝臟損傷發生損傷時,ITO細胞可被激活并分化為肌成纖維細胞,在此過程中,轉化生長因子-β(TGF-β)促進肌成纖維細胞的分化產生細胞外基質蛋白,特別是膠原蛋白(以Col1a1和Col 3a1型膠原為主)的產生.肝臟纖維化的發生是膠原合成代謝和降解代謝失衡的結果,細胞外基質的積聚是導致肝臟纖維化的關鍵病理生理因素[17-18].基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類重要的調節細胞外基質水解蛋白水解酶,在肝纖維化的發生發展過程中也發揮著著關鍵作用. MMP2是MMP家族重要成員之一,已證實其異常表達與肝臟纖維化密切相關[22-23].本研究結果顯示太原組小鼠肝臟中、、和的mRNA水平均顯著升高,而北京、杭州和廣州組小鼠肝臟中上述4種基因的表達均無明顯變化. Western blotting檢測的表達水平變化也進一步證實了太原市PM2.5誘發小鼠肝組織膠原沉積的結果.同樣地,Li等人也發現太原市冬季PM2.5暴露導致了大鼠肝組織中、和的mRNA和蛋白表達顯著上調,炎癥加重[24].基于上述結果,推測PM2.5誘導肝臟纖維化效應存在組分依賴性,太原市PM2.5中可能存在一些具有較強的誘導肝臟纖維化的組分,深入篩選與識別關鍵致毒組分具有重要意義.

PM2.5致小鼠肝臟纖維化的地區間效應差異與其負載的化學組分特征密切相關不同區域間PM2.5導致的毒性效應與健康結局不同,可能反映了區域間污染源以及大氣演化過程的差異,從而決定了區域間PM2.5化學成分的差異.我們前期發現[13],太原市冬季PM2.5中Cr、Mn、Cs、Pb、Bi、U和Fe元素的含量均大大高于其他3個城市.太原市PM2.5中的∑PAH濃度一年四季均最高(分別是北京2～10倍,杭州12～129倍,廣州4～15倍).我們推測,一方面,太原市的空氣污染特征已逐漸從典型的煤煙型污染演變為煤煙和機動車尾氣的混合污染[25].另一方面,太原市地理與氣象特征導致污染物輸送和稀釋能力較弱,污染物容易積聚[26].與太原PM2.5污染特征相區別的是,長三角和珠三角出現以高濃度臭氧為典型特征的光化學污染問題[27].在光化學污染過程中,多花芳烴等有機污染物可能轉化為生物毒性更強的痕量有機物[28].因此,廣州市和杭州市PM2.5處理組小鼠雖未表現出纖維化的特征,但也發生了較為明顯的肝臟病變,這種差異性的毒性終點可能與特定區域內大氣二次轉化生成的一些有機物種相關.本研究結果發現,肝臟纖維化與18種多環芳烴中的絕大多數與存在明顯相關性,而貢獻這一效應的金屬組分數量則相對較少.綜上所述,太原市PM2.5暴露誘導了小鼠肝臟纖維化的發生,部分金屬組分和絕大多數多環芳烴可能是誘導肝臟纖維化的關鍵毒性組分.

利用實驗動物模型甄別PM2.5誘發肝臟纖維化的關鍵毒性組分行之有效我們前期的數據表明[20],太原、北京、杭州和廣州組PM2.5流體力學尺寸分別為790.3±30.3、936.8±34.01、1364±46.51和938.2 ±51.75nm.此外,整個采樣期間四個城市的 PM2.5濃度均值顯示,太原、北京、杭州和廣州組PM2.5濃度分別為101.2、40.7、77.5和80.9 μg/m3.誠然,PM2.5的健康效應與其濃度、粒徑和化學組成密切相關.但目前對特定污染區域PM2.5的原位實時暴露尚處于起步階段,將PM2.5暴露于實驗動物的試驗方法用于反映實際人體實際環境暴露情況尚有局限.因此,本研究按照暴露-效應-關鍵組分識別的研究思路,在保證不同城市PM2.5劑量相同、粒徑相近的條件下采用咽后壁滴注的方式進行小鼠PM2.5暴露試驗,以期對PM2.5中可能導致肝臟纖維化的關鍵組分進行初步篩選,后續將以本研究初篩出的關鍵組分單獨或與誘導肝臟纖維化效應不明顯的城市PM2.5復合暴露于小鼠,再檢測肝臟纖維化的病理結構及標志物,進一步驗證PM2.5關鍵毒性組分的作用,闡明PM2.5致小鼠肝臟纖維化的區域毒性差異.總之,本研究為不同典型污染過程中細顆粒物主控效應成分的篩選與識別提供了較好的方法學與前期數據,有助于闡明地區間PM2.5誘導肝臟纖維化差異的根本原因.

4 結論

4.1 PM2.5暴露能夠誘導小鼠肝臟纖維化的發生,且存在區域差異性,太原市PM2.5誘導肝臟纖維化發生最為顯著,TGF-β及其通路中相關信號分子MMP2在介導PM2.5誘發肝臟纖維化發生中發揮了重要作用.

4.2 Cr、Mn、Mo、Cs、Pb、Bi、U和Fe等金屬組分與多環芳烴(PAHs)可能是PM2.5中誘導肝臟纖維化的一些關鍵成分.

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YAN Zhi-peng, LI Shu-yue, XING Qi-song, NAN Nan, QIN Guo-hua*, SANG Nan

(College of Environmental and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)., 2022,42(6)：2878～2885

To clarify the potential mechanism by which PM2.5exposure causes liver fibrosis and the key components leading to this adverse effect, 10-month-old C57BL/6 female mice were exposed to PM2.5from different cities of China (Taiyuan, Beijing, Hangzhou and Guangzhou) for 4weeks. And tissue section staining, qRT-PCR and Western-blot technique were used to evaluate the features of liver fibrosis in mice. Pearson correlation coefficient was used to analyse the correlation between the expression level of liver fibrosis-related genes in mice and the typical chemical composition of PM2.5from different cities. The results showed that a significant decrease in the organ coefficient of liver was found in Taiyuan and Hangzhou PM2.5-exposed group. Taiyuan PM2.5exposure significantly increased the area of collagen deposition and the relative expression level of fibrosis related genes (,,and) in the mice liver, and only PM2.5from Taiyuan induced the significant increase ofprotein in mice liver, while PM2.5from other cities except Taiyuan exposure did not cause any of the above changes in fibrosis related factors. In addition, the results of correlation analysis showed that the metal components such as Cr, Mn, Mo, Cs, Pb, Bi, U and Fe were positively correlated with the mRNA expression ofand. Except for NA, AC and BaP, the other 15PAHs were significantly correlated withmRNA expression, and the sum of 18EPA PAHs was significantly correlated with. The above results indicated that PM2.5exposure induced hepatic fibrosis in mice, especially PM2.5from Taiyuan. TGF-β and related signal molecules in its pathway has beenshownto play a vital role in mediating liver fibrosis induced by PM2.5. Cr, Mn, Mo, Cs, Pb, Bi, U, Fe and PAHs of PM2.5were probably critical components to induce liver fibrosis.

PM2.5；liver；fibrosis；critical component

X171.5

A

1000-6923(2022)06-2878-08

閆志鵬(1996-),男,山西晉中人,山西大學博士研究生,主要研究方向為環境毒理與健康.

2021-11-03

國家自然科學基金資助項目(22076109,21777091);職業安全健康北京市重點實驗室開放課題(2021)

* 責任作者, 教授, qinguojua@sxu.edu.cn