6:2氟調羧酸在蚯蚓體內的毒理效應及代謝轉化

宗玉璐,楊麗萍,趙淑艷*

6:2氟調羧酸在蚯蚓體內的毒理效應及代謝轉化

宗玉璐1,楊麗萍2,趙淑艷1*

(1.大連理工大學海洋科學與技術學院,工業生態與環境工程教育部重點實驗室,遼寧 盤錦 124221；2.南開大學環境科學與工程學院,天津 300071)

以赤子愛勝蚓()為受試生物,通過活體與離體實驗,研究6:2氟調羧酸(6:2FTCA) 在蚯蚓體內的毒理效應和代謝轉化機制.結果表明,6:2FTCA對蚯蚓體內丙二醛(MDA)含量和過氧化物酶(POD)活性無顯著影響,但能夠使過氧化氫酶(CAT)活性提高,使超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽轉移酶(GST)活性顯著升高,說明6:2FTCA對蚯蚓產生了氧化脅迫效應.6:2FTCA在蚯蚓細胞色素P450(CYP450)和GST酶提取液中的降解動力學均符合一級動力學模型,在CYP450(0.014/h)酶液中的降解速率明顯高于GST(0.006/h),其終端全氟羧酸(PFCAs)代謝產物為全氟己酸(PFHxA)、全氟戊酸(PFPeA)和全氟丁酸(PFBA),說明CYP450和GST參與了6:2FTCA在蚯蚓體內的代謝轉化,且CYP450貢獻大于GST.蚯蚓腸道好氧微生物對6:2FTCA具有顯著的降解效果,終端PFCAs降解產物為PFHxA和PFPeA,而腸道厭氧微生物對6:2FTCA無降解作用.

6:2氟調羧酸；蚯蚓；毒理效應；酶代謝；腸道微生物

多氟和全氟化合物(PFAS)被廣泛應用于工業和生活產品生產中,具有環境持久性、生物累積性和生物毒性等特點,是一類新型持久性有機污染物(POPs)[1-2].全氟辛酸(PFOA)是全氟羧酸(PFCAs)的一種典型代表產品,被美國環保署(EPA)列為疑似致癌物,于2015年停止相關產品生產[2].目前,國際上普遍采用短鏈同系物,如全氟己酸(PFHxA)和全氟丁酸(PFBA),或者一些含有非氟化結構部分的新型PFASs作為PFOA替代品[3].

6:2 氟調羧酸(6:2FTCA,C6F13CH2COOH)作為一種新型的PFOA替代品,被廣泛應用于表面活性劑和含氟乳化劑等氟化工原料生產中,在生產和使用過程中釋放到各種環境介質中[2,4].另外,一些PFCAs前體物質也能夠在環境中通過生物和非生物途徑轉化為6:2FTCA,導致環境介質和生物體中6:2FTCA的污染[5-8].據報道,德國廢水樣品中6:2FTCA最高濃度為8.62μg/L[9],北美地表水中濃度達到10μg/L[9],山東德州土壤和植物中檢出6:2FTCA最高濃度分別為0.12ng/g和0.57ng/g[10],黃河中游水相和顆粒相中檢測到的6:2FTCA最高濃度分別為0.254ng/L和2.88ng/g[11].6:2FTCA對小鼠肝臟的毒性要較PFOA低[3],對斑馬魚胚胎具有發育毒性且能夠抑制胚胎發育過程中紅細胞的形成[9],對大型水蚤、搖蚊、浮萍和端足蟲等表現出比PFOA更強的毒性[12-13].但是,6:2FTCA對陸生無脊椎動物的毒性尚不明確.雖然全氟化的PFCAs表現出較強的穩定性,但是一些含有非氟化結構的PFASs能夠發生降解轉化.目前,尚無以6:2FTCA作為母體化合物進行降解轉化研究的報道,而6:2FTCA作為一些多氟物質中間代謝產物的相關研究報導較多.6:2 氟調醇(6:2FTOH)[4-8,14-15]、6:2氟調聚物磺酰胺烷基甜菜堿(6:2FTAB)[16]和6:2氟調磺酸(6:2FTSA)[17-18]等PFCA前體物質,都能夠在環境介質或者動植物體內被降解生成中間產物6:2FTCA,隨后6:2FTCA再進一步轉化生成終端產物PFCAs.因此,推測6:2FTCA在環境中會被轉化為持久性更強的PFCAs,是環境中PFCAs的潛在來源,其生態環境風險不可忽視.

蚯蚓是典型的陸生無脊椎動物,常被用作評價土壤外源化學污染物生態風險的指示生物[19].污染物在蚯蚓體內發生攝食、吸收、代謝轉化和排泄等復雜的生物過程,而污染物在蚯蚓體內的代謝轉化可能同時包括蚯蚓組織中的酶代謝和腸道中的微生物降解.細胞色素P450酶(CYP450)屬于I相代謝酶,是廣泛存在于生物體內的血紅素酶系,催化的反應機制包括環氧化、脫烷基、羥基化和脫硫等[20].谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)屬于II相代謝酶,催化結合反應使結合物更易于排出體外達到解毒的目的[21-22].研究顯示,CYP450和GST是一些PFCAs前體物質在動植物體內發生代謝轉化的關鍵酶[15,23-24]. CYP450和GST能夠參與6:2FTSA在蚯蚓體內的代謝轉化[22],CYP450是6:2FTSA在南瓜體內降解轉化的關鍵酶[24],GST參與了6:2FTOH在大豆組織中的代謝[15].蚯蚓腸道特有的微生境中存在大量的厭氧和好氧細菌,這些細菌對一些有機污染物在蚯蚓體內的降解具有一定的貢獻,如六氯環己烷(HCH)[25]和硫丹[26]能被蚯蚓腸道內分離出來的細菌所降解.然而,蚯蚓腸道微生物對全氟辛烷磺酰胺(FOSA)并未表現出降解能力[27].6:2FTCA能否在蚯蚓代謝酶及腸道微生物作用下發生降解,還有待進一步研究.

本研究以赤子愛勝蚓()作為模式動物,通過活體()和離體()實驗相結合的方式,研究6:2FTCA在蚯蚓體內的生態毒理效應和代謝轉化機制.通過分析氧化應激標志物的變化,如丙二醛(MDA)含量變化,過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和GST活性變化,闡明6:2FTCA對蚯蚓的毒理效應;通過分析代謝酶(CYP450和GST)對6:2FTCA的代謝轉化規律和蚯蚓腸道微生物對6:2FTCA的降解特性,揭示6:2FTCA在陸生動物體內代謝發生的內在機制和主要控制因素.為準確評估環境中6:2FTCA的生態風險和PFCAs的來源提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

6:2FTCA(98%)、全氟庚酸(PFHpA,98%)、全氟戊酸(PFPeA,97%)購自北京百靈威科技有限公司,全氟己酸(PFHxA,98%)購自Matrix Science公司,三氟乙酸(TFA,99%)、五氟丙酸(PFPrA,97%)和全氟丁酸(PFBA,98%)購自上海麥克林生化科技有限公司.煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)購自Biosharp.葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和葡萄糖-6-磷酸鈉(GLC-6-PO4)購自Sigma-Aldrich(中國).高效液相色譜(HPLC)級甲醇(99.9%)和甲基叔丁基醚(MTBE)等購自大連博諾生化試劑有限公司.

1.2 活體暴露實驗

供試土壤采自遼寧盤錦農田(種植蔬菜,周邊無污染源)0～10cm的表層土壤,自然風干14d后過2mm篩,將配好的6:2FTCA甲醇儲備液加入土壤中,混勻后放入通風櫥中于室溫下平衡4d[23]. 測得實驗土壤中6:2FTCA的初始暴露濃度為62.0ng/g干重(dw).赤子愛勝蚓()購自遼寧華電環保科技有限公司蚯蚓養殖場(沈陽).室溫(22～27℃)下馴化培養14d,挑取帶有生殖環帶的成熟蚯蚓(10條),清腸24h后放入裝有100g染毒土壤(含水率為30%)的燒杯中,同時設置空白對照組(暴露于未染毒土壤中),室溫下分別培養1,2,4,6,8,12,16和20d,每個處理設3個重復(=3)[19].取樣后,將蚯蚓清腸、清洗后,立即放入冷水浴中處理.

1.3 蚯蚓粗酶提取液的制備

將蚯蚓樣品(約0.3g)放入手動勻漿器中,再以1:9的比例加入磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH 7.5),在冰水浴中研磨成勻漿[22].將蚯蚓勻漿在4℃、12000r/min下離心10min,收集上清液,于-80℃保存.用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA含量,以牛血清蛋白為標準用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量,氮藍四唑(NBT)光化還原法測定SOD活性,愈創木酚法測定POD活性,紫外吸收法測定CAT活性,GST活性采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)比色法測定[22,28-29].MDA含量用nmol/g蛋白質表示,GST用nmol/min/mg蛋白質表示,其他酶活性(SOD、POD和CAT)用U/mg蛋白質表示.

1.4 體外暴露實驗

將已清腸24h的蚯蚓放入甘油溶液中(15min, 0℃,20%)實施安樂死,然后用0.15mmol/L KCl溶液沖洗蚯蚓表面黃色液體后放入玻璃勻漿器中,以蚯蚓:緩沖液(0.1mol/L,pH=7.4,1mol/L EDTA, 0.15mmol/L KCl)=4:1的比例研磨成蚯蚓組織勻漿液.根據Kunze等[30]的方法稍作改動進行GST酶液提取(操作溫度為0～4℃).取一部分勻漿于10000離心20min,上清液再于100000離心50min后過0.22μm濾膜,然后過GST瓊脂糖純化樹脂進行凈化后得到GST酶提取液.GST酶液保存在0.05mol/L磷酸鹽和0.5μmol GSH(內含有10mmol/L KNO3+ 0.05mmol/L EDTA+ 2mmol/L NADH+3mM Na2MoO4)中,放入-80℃冰箱保存.根據Yang等[31]的實驗方法提取CYP450粗酶液(0～4℃).另取一部分勻漿,于15000離心20min,上清液再于150000離心90min得到CYP450酶液粗提物.使用蚯蚓CYP450和GST ELISA試劑盒在酶標儀(美國Molecular Device)上測定蚯蚓勻漿和粗酶提取液中CYP450總量和GST含量.

在上述蚯蚓GST酶提取液(1mL)、CYP450酶提取液(0.5g)中分別加入50μL 6:2FTCA及經預培養的500μL NADPH再生系統(1.6mmol/L NADP+, 3.3mmol/LGlc-6-PO4,0.4U/mL,G6PDH,3.3mmol/L MgCl2+3.95mL磷酸鹽緩沖液)在水浴搖床中(室溫25℃、120rpm)進行體外培養實驗,培養容器聚丙烯(PP)管用錫箔紙包裹.分別于0,2,6,8,12,24和32h進行取樣.實驗同時設置空白對照組Ⅰ(酶液),對照組Ⅱ(6:2FTCA+沸水于100℃中煮5min滅活后的酶液)和對照組Ⅲ(6:2FTCA),分別培養2h和32h后進行取樣.所有實驗均設置3組平行(=3).取樣時,PP管中加入1/2體積甲醇并漩渦混勻1min以停止孵育反應,置于-20℃保存,留待PFASs提取與分析.

1.5 蚯蚓腸道微生物對6:2FTCA的降解實驗

采用以往實驗方法并稍加改進[32].將在6:2FTCA染毒土壤中馴化20d后的蚯蚓清腸并清洗干凈,用75%的酒精麻醉蚯蚓后,取下蚯蚓胃以下的腸道.將0.1g(鮮重, ww)腸道放入滅菌手動勻漿器中,加入1mL經滅菌的預冷PBS(0.1mol/L,pH=7.0)均勻研磨至無明顯顆粒.

好氧降解實驗:在無菌操作情況下,取1mL的蚯蚓腸道勻漿液加入到100mL LB液體培養基進行混菌富集培養(水浴搖床,100r/min),取已培養至對數期的一代菌群于LB液體培養基中再馴化,二代菌群培養至對數期.取50mL培養到二代對數期的懸浮液加到離心管中進行離心(300r/min,10min)去掉其中的液體LB,取0.2mL腸道微生物懸浮液加入到裝有6:2FTCA染毒處理的MSM培養基的PP瓶中,混合均勻后在水浴搖床中(25℃,100r/min)于好氧條件下進行培養.

開幕式由中國煤炭工業協會副會長兼秘書長姜志敏主持，中國煤炭工業協會副會長梁嘉琨致辭。全國政協常委、中國煤炭工業協會會長王顯政，國家安監總局副局長、國家煤礦安全監察局局長付建華，國家能源局煤炭司副司長李豪峰，中國工業經濟聯合會常務副會長、中國煤炭工業協會副會長路耀華，中國煤炭加工利用協會理事長呂英，印度和烏克蘭的選煤協會主席以及山東、陜西一些地方政府領導和神華、中煤能源、鞍山重機等企業的領導出席了開幕式。

厭氧降解實驗:在厭氧手套箱內,另取1mL的蚯蚓腸道勻漿液加入到脫氧的LB液體培養基中,移出厭氧手套箱后置于水浴搖床(25℃,100r/min)中培養至二代對數期,離心后取0.2mL懸浮液加入到脫氧的MSM培養基(6:2FTCA)中于厭氧手套箱中進行降解實驗.

實驗全程避光,分別設置6:2FTCA為唯一碳源組(6:2FTCA+腸道微生物,F+M)、排除非生物干擾組(6:2FTCA+煮沸腸道,C)、6:2FTCA和外加碳源組(6:2FTCA+0.5%葡萄糖+腸道微生物,F+M+G),同時設置空白對照組.實驗進行48h后,將與降解培養實驗相同體積的甲醇加入到PP瓶中,旋渦震蕩至混合均勻,-20℃保存,留待PFASs提取與分析.

1.6 樣品前處理和儀器分析方法

土壤、蚯蚓和腸道微生物樣品提取與純化參照以往方法[27].使用Waters 超高效液相色譜(ACQUITY-UPLC)-質譜(MS, XEVO-TQS)聯用儀,在負電噴霧電離模式下(ESI)對樣品中PFASs含量進行定量分析.色譜柱為Waters UPLC C18 (1.7μm, 2.1mm×50mm),柱溫為38℃.流動相為甲酸銨水溶液(A,2mmol/L)和甲醇(B),流速為0.45mL/min,進樣體積為10μL,梯度洗脫條件:0～ 0.5min,25%B;0.5～5.0min,25%～85%B;5.0～5.1min, 85%～100%B;5.1～8.0min,100%B;8.0～10.0min,100%～ 25%B.質譜條件:毛細管電壓-2.2kV,霧化氣流速7.00bar,脫溶劑氣流800L/h,錐孔氣流150L/h,離子源溫度150℃,去溶劑溫度400℃.各PFASs的定量參數列于表1.

表1 PFASs的定量離子、錐孔電壓和碰撞能

1.7 質量保證與質量控制

回收率采用空白基質加標,降解實驗采用相同的步驟制備方法空白樣,采用添加基質的外標法定量,方法檢出限(MDL)信噪比為3:1.各基質中PFASs的回收率范圍為81.4%～117.5%,所測目標物不進行回收率校正.PFASs在酶液和腸道微生物培養基中的MDLs分別為0.0017～0.0187pmol/g ww和0.0015～ 0.0029pmol/mL.

1.8 數據處理與分析

6:2FTCA在蚯蚓酶液中的降解速率常數(,1/h)由如下公式計算:

式中:C和分別為(h)時刻和孵育開始時蚯蚓酶液中6:2FTCA的濃度(nmol/g ww).

6:2FTCA暴露組與空白對照組毒理指標的差異顯著性用單因素方差分析(ANOVA)和配對樣本T檢驗進行統計學分析,腸道微生物對6:2FTCA降解影響的組間差異用Tukey’s檢驗其顯著性(IBM SPSS Software, 22.0).<0.05認為有顯著差異.

2 結果與討論

2.1 6:2FTCA對蚯蚓的毒理效應

圖1 6:2FTCA對蚯蚓體內MDA含量(A),POD(B)、SOD(C)、CAT(D)和GST(E)酶活性的影響

*<0.05

污染物進入機體后會激活機體的抗氧化防御系統以防止氧化損傷,包括酶(SOD、CAT、和POD等)和非酶抗氧化系統(脂質過氧化指標MDA等).在受到外源物質脅迫時,生物體內抗氧化系統為清除氧自由基或活性氧簇(ROS)會被誘導[28,33].如圖1A所示,在暴露期間,6:2FTCA染毒組蚯蚓體內MDA含量與對照組相比無顯著變化(>0.05).本課題組前期研究顯示,相同及更短全氟碳鏈長度的PFCAs(TFA、PFPrA、PFBA、PFPeA、PFHxA、PFHpA)也未對蚯蚓體內MDA含量產生顯著影響[34],這說明在6:2FTCA染毒土壤(62.0ng/g dw)中暴露20d后,6:2FTCA及其終端代謝產物對蚯蚓細胞均無明顯的脂質過氧化作用.在暴露實驗中(4～20d),處理組與對照組相比,SOD(圖1B)活性顯著提高41.4%～ 74.3%(<0.05),CAT(圖1C)活性增加37.2%～44.4% (>0.05),而POD(圖1D)活性基本無變化(>0.05).研究報道,6:2FTCA同系物8:2FTCA能夠引起水生生物部分抗氧化應激標志物呈現出不同程度的氧化應激響應,如MDA含量增加、SOD活性增強,而CAT活性變化不顯著[33].SOD活性變化用來表示遭受外源化學物污染后引起生物機體氧化脅迫的大小,是生物機體抗氧化系統的第一道防線,通過歧化反應將O2-催化為H2O2和O2,再被CAT和POD等H2O2清除酶捕獲[28,35].SOD被顯著誘導,說明蚯蚓已經受到氧化脅迫.6:2FTCA處理組中CAT活性與空白對照組相比,雖然數理統計分析顯示不顯著(>0.05),但其活性增加了37.2%～44.4%(4～20d),整體呈現一定的誘導效應,而POD活性基本無變化,說明在清除蚯蚓因暴露于6:2FTCA染毒土壤中而引起的H2O2的過程中,CAT比POD發揮了更為重要的作用.

2.2 CYP450和GST酶提取液對6:2FTCA的代謝轉化

圖2 CYP450(A, nmol/g ww)和GST(B, nmol/g ww)酶液中PFASs含量隨時間的變化

粗酶提取液中CYP450總量和GST含量約是蚯蚓整體勻漿中含量的160倍.為了證實代謝酶在6:2FTCA生物轉化中的作用,將蚯蚓的粗酶提取物(CYP450和GST)體外暴露于含有6:2FTCA的輔酶再生系統中.在空白對照組Ⅰ中未檢測到PFASs,對照組Ⅱ中6:2FTCA沒有明顯的消耗,對照組Ⅲ中除6:2FTCA外未檢測到其他PFASs,說明6:2FTCA在體外試驗過程中無背景干擾,且微生物和光降解可忽略不計.在培養實驗結束后,CYP450和GST粗酶液中PFASs總物質的量回收率為初始加入6:2FTCA物質的量的73.2%和89.7%,可能是由于部分物質揮發、容器吸附或其他未進行檢測的中間代謝物(6:2FTUCA、5:3FTUCA、5:2sFTOH、5:3FTCA等)所致.

如圖2所示,體外培養2h后, CYP450和GST酶液中母體化合物6:2FTCA的濃度開始下降,并且隨著培養時間延長而逐漸降低.體外培養32h后,6: 2FTCA在CYP450和GST酶液中轉化率分別為47.4%和20.7%.體外降解動力學符合一級衰減動力學模型,在CYP450和GST酶液中降解速率常數分別為0.014/h (2=0.890,<0.01)和0.006/h (2=0.941,<0.01).以上結果說明蚯蚓體內CYP450和GST在6:2FTCA生物轉化中起關鍵作用,且6:2FTCA在CYP450酶溶液中的生物轉化率和轉化速率都比在GST酶溶液中要高,表明CYP450對6:2FTCA在蚯蚓體內生物轉化的貢獻要大于GST.此現象與其前體物質6:2FTSA在蚯蚓體內的酶代謝轉化規律相似[27].

圖3 不同實驗組終端PFCA代謝產物物質的量比例

體外培養過程中,在粗酶液(CYP450和GST)中檢測到了3個PFCA代謝終產物,包括PFBA、PFPeA和PFHxA(圖2).隨著培養時間延長,PFBA、PFPeA和PFHxA的含量逐漸升高,說明6:2FTCA能夠在蚯蚓體內I相和II相代謝酶的作用下代謝轉化生成3種不同碳鏈長度的PFCAs終產物.6:2FTCA在CYP450和GST粗酶液中代謝產物的物質的量百分比分別如下: PFHxA(40.2%)>PFBA(31.3%)>PFPeA (28.5%),PFBA(49.3%)>PFPeA(27.0%)>PFHxA(23.7mol%)(圖3).PFBA和PFHxA分別是CYP450和GST粗酶液中主要的PFCA終端代謝產物.根據6:2FTCA終端降解產物的組成,推測6:2FTCA在蚯蚓粗酶液中的代謝轉化路徑如下: 6:2FTCA脫-HF后生成6:2FTUCA,再通過-氧化途徑發生CH2-CH2, CH2-CF2和CF2-CF2鍵斷裂,最終生成穩定的PFCA終端產物.然而,在蚯蚓體內未檢測到PFHpA,說明6:2FTCA在蚯蚓體內并未發生-氧化.此代謝轉化路徑與6:2FTOH在植物體內的降解有些類似,即6:2FTOH通過連續脫氫和氧化作用生成6:2FTCA,然后再通過氧化和脫除一或者兩個碳生成PFPeA和PFHxA[15].

2.3 蚯蚓腸道微生物對6:2FTCA的降解

暴露于有機污染物的蚯蚓腸道中含有大量的好氧和厭氧降解微生物.為了進一步研究蚯蚓腸道微生物對6:2FTCA的降解能力,模擬蚯蚓腸道環境分別進行好氧和厭氧降解實驗.在好氧實驗過程中,與初始加入培養基中的6:2FTCA濃度(F)相比,非生物干擾組(C)無顯著變化,說明本實驗過程中非生物干擾可忽略(圖4).在以6:2FTCA為唯一碳源組(F+M)和外加碳源組(F+M+G)中,6:2FTCA濃度顯著降低(<0.05),檢測到PFHxA和PFPeA兩種PFCAs終端降解產物.PFCA在F+M和F+M+G微生物實驗組中的物質的量百分比分別如下:PFHxA(91.4%) >PFPeA (8.6%)和PFHxA(90.2%)>PFPeA (9.8%)(圖3).另外,外加碳源組(F+M+G)降解效果明顯強于以6:2FTCA為唯一碳源組(F+M),說明添加葡萄糖作為共代謝底物后,可能對好氧微生物共生網絡產生了影響,從而促進了6:2FTCA的降解.而在厭氧環境中,各實驗組之間無顯著差別,且未檢測到任何PFCAs產物.以上結果說明,蚯蚓腸道微生物在好氧環境下對6:2FTCA有明顯的降解作用,而在厭氧環境下幾乎無降解作用.

蚯蚓腸道微生物能夠降解一些有機污染物,如六氯環己烷(HCH)[25]和硫丹[26].但是對殺蟲劑克線磷[34]和FOSA等的降解較差[27].6:2FTCA前體物質在好氧情況下能夠被微生物降解生成包括6:2FTCA在內的一系列中間產物,然后再進一步降解轉化生成終端產物PFCAs.6:2FTOH能被污泥好氧堆肥微生物[14]、土壤好氧微生物[37]、烷烴降解菌和氟乙酸降解菌[38]等降解轉化,6:2FTSA能被土壤[39]和沉積物[18]中的有氧微生物降解,生成6:2FTCA及其它中間產物,再經過脫除HF和-CF2-生成PFBA、PFPeA和PFHxA.另外,也有一些研究表明,6:2FTCA前體物質在厭氧環境下降解較為困難,如6:2FTSA[17]在土壤厭氧微生物作用下不發生降解,6:2FTOH在厭氧污泥中能降解為包括6:2FTCA在內的一些中間產物,但是不能再將6:2FTCA進一步降解生成PFCAs[38].因此,普遍認為,在厭氧產甲烷的環境下,缺少能將6:2FTCA等PFCA前體物質進一步氧化脫羧生成PFCAs的生化機制.

圖4 蚯蚓腸道好氧微生物(A)和厭氧微生物(B)對6:2FTCA的降解作用.不同字母表示各值之間差異顯著性

<0.05

雖然蚯蚓腸道好氧微生物對6:2FTCA降解產生的主要PFCA終端產物(PFPeA和PFHxA)與上述文獻中報道的微生物降解(PFBA、PFPeA和PFHxA)有所區別,但是均證明了6:2FTCA在厭氧微生物作用下不能發生降解轉化,而能夠在好氧微生物作用下發生降解,且降解過程中只發生-氧化而沒有發生-氧化.綜上,6:2FTCA能夠在蚯蚓腸道好氧微生物作用下通過-氧化、脫除-HF和碳鍵斷裂等作用生成不同碳鏈長度的PFPeA和PFHxA,而在蚯蚓腸道厭氧菌作用下不發生降解.

3 結論

3.1 在6:2FTCA(62.0ng/g dw)染毒土壤中暴露20d后,蚯蚓體內雖未顯示明顯的脂質過氧化,但是部分關鍵抗氧化酶出現了一定的氧化應激效應.

3.2 CYP450和GST能夠參與6:2FTCA在蚯蚓體內的代謝轉化,最終降解產物為PFBA、PFPeA和PFHxA,且CYP450對6:2FTCA在蚯蚓體內生物轉化的貢獻要明顯高于GST.

3.3 蚯蚓腸道好氧微生物對6:2FTCA具有明顯的降解作用,終端PFCAs降解產物為PFPeA和PFHxA,而腸道厭氧微生物對6:2FTCA基本無降解作用.

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Toxicological effects and biotransformation mechanism of 6:2fluorotelomer carboxylic acid (6:2FTCA) in earthworms ().

ZONGYu-lu1, YANG Li-ping2, ZHAO Shu-yan1*

(1.Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, Ministry of Education, School of Ocean Science and Technology, Dalian University of Technology, Panjin 124221, China；2.School of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China)., 2022,42(6)：2886～2893

Earthworms () were exposed to the soil spiked with 6:2 fluorotelomeric carboxylic acid (6:2 FTCA) to investigate the toxicological effects and biotransformation mechanisms of 6:2 FTCA in earthworms afterandexposure. Compared to the controls, no significant effects were observed in malondialdehyde (MDA) contents and peroxidase (POD) activities, while catalase (CAT) activities were increased, and superoxide dismutase (SOD) and glutathione-s-transferase (GST) activities were significantly induced in 6:2 FTCA treatments. This suggested that 6:2 FTCA induced oxidative stress in the earthworm cells. Biodegradation of 6:2 FTCA in the earthworm cytolchrome P450 (CYP450) enzyme extracts and GST enzyme extracts fitted well with the first order kinetics. The biodegradation rate in CYP450 extracts (0.014/h) was much higher than that in GST extracts (0.006/h), indicating CYP450 and GST were involved in the enzymatic transformation and CYP450 contributed more than GST to 6:2 FTCA biotrans formation in earthworms. Three terminal perfluorocarboxylic acid (PFCA) metabolites, including perfluorohexanoic acid (PFHxA), perfluoropentanoic acid (PFPeA) and perfluorobutanoic acid (PFBA) were observed in the enzyme extracts. The results of gut microbial degradation test showed that aerobic microorganisms contributed to 6:2 FTCA biodegradation in earthworms significantly, and the terminal PFCA metabolites were PFHxA and PFPeA, but anaerobic microorganisms didn’t contribute to 6:2 FTCA biotransformation in earthworms.

6:2 FTCA；earthworm；toxicological effects；enzyme metabolism；gut microorganisms

X171.5

A

1000-6923(2022)06-2886-08

宗玉璐(1995-),女,河南洛陽人,大連理工大學碩士研究生,主要從事研究方向為有機污染物環境行為.

2021-11-22

國家自然科學基金項目(41603106,42177374);中央高校基本科研業務費專項(DUT21JC42)

* 責任作者, 副教授, zhaoshuyan@dlut.edu.cn