蓮中原花青素的研究進展

劉騰飛，陸皓茜，李軍*，楊代鳳，朱松

1(江蘇太湖地區農業科學研究所，江蘇 蘇州，215100)2(江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

蓮(NelumbonuciferaGaertn.)也被稱為中國睡蓮、圣蓮或印度蓮，是一種睡蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(NelumboAdans)多年生水生草本植物(圖1)，根據形態和利用部位，分為子蓮、花蓮和藕蓮3種類型。我國是蓮的主要起源地之一，蓮種植歷史悠久，種質資源豐富。近年來，我國蓮產業規模穩步發展，種植區域面積逐步增大，其中藕蓮、子蓮種植面積分別達到4.0×105、1.0×105hm2[1-2]。蓮的各個部位可食用或藥用，其根狀莖即蓮藕或藕帶可作蔬菜食用，鮮蓮子可作水果食用，花可供觀賞或藥食，蓮葉、蓮房、蓮子、蓮心、蓮須與藕節等皆可入藥，由于富含生物堿類、黃酮類等活性物質成分[3]，賦予其多種藥理活性，如良好的預防心血管疾病、抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗菌、抗病毒、降血糖、調脂減肥等作用[4]，其中原花青素是一類天然多酚黃酮類化合物，以其強大的抗氧化性能而聞名，已被證實是蓮發揮藥理作用的重要活性物質之一[5]。近年來國內外眾多學者對蓮中原花青素開展了研究工作，主要集中在其提取分離、抗氧化活性、藥理作用等方面[6-8]，但相關研究還不充分，尚無針對蓮中原花青素的檢測標準體系，其產品開發利用仍較少，提取分離工藝、毒理學等方面的研究有待深入。本文對蓮中原花青素的組分構成、提取分離、檢測分析及在食品中的應用等方面研究進行綜述，以期為后續深入研究蓮中原花青素及其開發利用提供參考。

圖1 蓮全株示意圖[9]Fig.1 Schematic diagram of the whole lotus plant

1 蓮中原花青素的組分構成

原花青素(proanthocyanidins, PCs)又稱縮合單寧，是一類由黃烷-3-醇結構單元通過C—C鍵縮合形成的不同聚合度的混合物[10]，因在熱酸性溶液中可轉化成花青素而得名，是廣泛存在于植物中的天然多酚化合物，在葡萄籽(232.1 mg/g)[11]、花生衣(144.1～170.3 mg/g)[12]等植物組織中含量較高。按照黃烷-3-醇之間連接方式的不同，分為A型和B型，前者由1個碳鍵C4→C8或C4→C6和1個醚鍵C2→O→C7連接形成，后者通過1個碳鍵C4→C8或C4→C6連接形成，其中A型結構更細長、更堅固，性質更穩定[13]；按照其聚合度的不同，分為低聚體(聚合度≤4)和高聚體(聚合度>4)，其中低聚體抗氧化活性更強，生物利用度更高[14]。

以往研究表明，不同品種及產地蓮中PCs含量存在差異[15-16]，蓮不同部位中PCs含量也不相同，從高到低依次為：蓮房>藕節>蓮葉>荷梗，以蓮房中含量最高(7.8%, 干重)[16]，且眾多研究顯示，蓮中PCs以B型為主，構成單元包括(+)-兒茶素(catechin, C)、(-)-表兒茶素(epicatechin, EC)、(+)-沒食子兒茶素(gallocatechin, GC)和(-)-表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)(圖2)，并且主要由單體、二聚體及三聚體組成，其中二聚體含量最高(占比為43.5%)，其次為三聚體(占比為37.4%)和單體(占比為3.25%)[17-20]。目前蓮中已知的PCs的類型如表1所示。

表1 蓮中的原花青素類型[5, 17-25]Table 1 Proanthocyanidins isolated from lotus

圖2 蓮原花青素中黃烷-3-醇主要結構單元Fig.2 Structures of the flavan-3-ol units in proanthocyanidins from lotus

2 蓮中原花青素的提取分離

2.1 樣品預處理

樣品預處理是蓮中PCs提取分離的重要環節之一，適當的預處理方式是保證PCs提取效率的重要前提。樣品的粒度和水分含量是影響植物樣品中PCs提取效率的2個重要因素。理論上，樣品越細與溶劑接觸面積越大，提取效率越高，但樣品過細大量細胞破裂，造成不溶性雜質溶出，給后續分離提純帶來困難。樣品中水分含量的增加會引起多酚氧化酶等一些酶促反應，從而降低樣品的穩定性[10]。然而，干燥過程中失水會導致細胞收縮，從而降低細胞中PCs的提取效率。由于PCs是熱不穩定型色素，對溫度、光及pH敏感[26]，為防止其氧化和降解，應存放在避光、低溫及弱酸性條件下。根據現有的研究報道，新鮮的蓮樣(蓮房、蓮葉、蓮藕等)采集回來后，用水洗凈[24-25,27]，然后在-20 ℃冷凍保存[24]，或熱風干燥(≤50 ℃)至恒重(含水量<10%)[16,22-23,25,27]，粉碎，過40～100目篩[5,22-23,25,27-28]，置于干燥器內，在-20 ℃保存備用。不同的干燥方法對蓮中PCs提取得率具有顯著的影響。以蓮房為例，采用不同干燥方法獲得的PCs含量由高到低順序為：50 ℃恒溫烘干>通風避光處陰干>日光下直接曬干[15]，而采用-20 ℃ 冷凍48 h后自然風干的干燥方法比直接曬干的方法，PCs提取得率提高了47.6%[20]。

2.2 提取方法

PCs分子中含有多個酚羥基官能團，屬強極性物質，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑，由于在不同溶劑中溶解度有差異，可采用適當濃度(50%～75%,體積分數)的有機溶液進行提取。LI等[5]采用丙酮溶液提取蓮子皮中PCs，按照料液比1∶54(g∶mL)，丙酮體積分數為67%、pH為2.7，溫度37 ℃，時間90 min的條件進行提取，再用乙酸乙酯提取3～4次，經分離后得到蓮子皮原花青素純化物。表2列舉了近年來有關蓮中PCs主要的提取方法，包括有機溶劑提取法[17-21,25,27]、酶輔助提取法[28-30]、超聲輔助提取法[31-32]、微波輔助提取法[33]和脈沖超聲輔助提取法[34]，以及各提取方法的原理、應用實例和優缺點。其中以乙醇溶液為提取劑的溶劑提取法使用最普遍，輔以酶、微波和超聲波等手段協同使用，有效利用各提取方法的優勢，能夠快速并有效地提高蓮中PCs的提取效率和得率，并且操作簡單易行，被廣泛應用于蓮中PCs的提取，不同提取手段的協同使用以達到優異的提取效果將是今后蓮中PCs提取的發展方向。

表2 蓮中原花青素的提取工藝方法Table 2 The extraction methods of proanthocyanidins in lotus

2.3 分離純化方法

從蓮的不同部位提取的PCs粗提物中往往含有脂類、葉綠素、鞣質及其他酚類化合物等雜質成分，需進一步分離純化得到較高純度的產品，才能用于結構鑒定、功能研究、產品開發等方面。目前蓮中PCs粗提物的分離與純化沿襲了傳統的分離純化方法，主要包括溶劑萃取法[5,20-21]、大孔樹脂吸附法[17-19,23-24,27]、凝膠色譜法[16,19-20]、高速逆流色譜法[25]及膜過濾法[35]等。

表3列舉了各分離純化方法的原理、應用實例和優缺點。其中大孔樹脂吸附法對PCs具有良好的分離純化效果，由于操作簡單、綠色環保，適合產業化等優勢，目前在蓮中PCs分離純化中應用最廣。通過對樹脂靜態吸附和解吸能力的考察，AB-8、HPD-400、HPD-100、DA-201等商品大孔樹脂，由于對蓮中PCs吸附選擇性強、吸附容量高、解吸條件溫和、再生簡便等特點而得到廣泛應用。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜柱可以有效去除糖、葉綠素等色素和大多數酚類干擾物質，應用也很普遍。由表3可知，各方法在分離純化蓮中PCs應用上各有優劣，由于粗提物成分復雜，因此綜合利用多種純化手段，最大程度地發揮各方法的優勢進行多級純化是今后蓮中PCs分離純化的發展方向。LIU等[21]從蓮房中提取PCs，利用AB-8大孔樹脂(Φ1.5 cm×35 cm)初步純化，以蒸餾水、50%乙醇洗脫得到大孔樹脂純化物，再經Sephadex LH-20凝膠柱(Φ3.2 cm×40 cm)純化，依次用蒸餾水、25%甲醇、50%甲醇、70%丙酮洗脫，獲得了較顯著純化效果，純度可達98%以上。張娣等[36]采用膜過濾法結合大孔樹脂吸附法對蓮房中PCs進行分離純化。利用PAN超濾膜獲得透過液，再經HZ-806大孔樹脂純化，得到PCs收率在85%以上，純度達81%，是單獨使用HZ-806樹脂吸附法純度的1.3倍。由于膜分離能耗低，大孔樹脂反應條件溫和，該方法工業化應用前景廣闊。

表3 蓮中原花青素的分離純化方法Table 3 The separation and purification methods of procyanidins in lotus

3 蓮中原花青素的檢測分析

3.1 含量檢測技術

目前對于蓮中PCs含量的測定還沒有統一的檢測標準方法，分光光度法、HPLC等是常用的蓮中PCs含量的測定技術，其中以分光光度法應用最為普遍，包括紫外可見分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-Vis)和近紅外分光光度法(near infrared spectrophotometry, NIR)。

UV-Vis法主要用于測定蓮中PCs的總量，一般以香草醛為顯色劑，利用原花青素A環上的間苯二酚或間苯三酚結構在強酸介質中與香草醛加合，生成有色的化合物，在500 nm下有最大吸收峰，且在一定濃度范圍內，PCs濃度與吸光值之間存在良好的線性關系。通常以甲醇作為溶劑，以兒茶素作為標準品，酸介質一般采用硫酸或鹽酸。該方法簡單快速，但特異性不強，易受到樣品中相同光譜特征的共存雜質成分的影響。CAO等[17]采用香草醛-硫酸法測定蓮子殼和蓮房中PCs的含量。取0.5 mL樣液，分別加入2.5 mL的30 mg/mL香草醛溶液及30%硫酸溶液，室溫避光反應20 min，測得蓮子殼和蓮房中PCs含量分別為44.40、91.50 mg/g干重。高亮等[25]采用香草醛-鹽酸法測定荷葉中PCs含量，其最佳測定條件為：取1.0 mL樣液，加入5 mL體積比1∶1混合的1%香草醛甲醇溶液與8%鹽酸甲醇溶液，避光條件下，30 ℃水浴加熱30 min后測定。在實際定量分析中，以1.0 mL不同濃度的兒茶素為標準品代替樣液，測定吸光度值并繪制標準曲線，計算樣品中PCs含量。香草醛-鹽酸法測定PCs含量時單體和低聚體均參加反應，測得結果比真實值偏高，而香草醛-硫酸法中，在加入硫酸時產生很高的熱量，會使PCs氧化發生分解，造成測定結果偏低。

NIR法利用PCs結構中的基團在近紅外光譜區特定的吸收光譜，通過建立校正模型實現對樣品的定量分析。該技術用于測定蓮房中PCs含量，建模所需樣品數量多，將蓮房樣品通過30目篩，以紫外-可見分光光度法為對照方法，通過二階導數和Savitzky-Golay平滑濾波處理，選取7 500～6 900 cm-1波段，運用偏最小二乘法建立蓮房中PCs含量與NIR法光譜之間的多元校正模型，實現對PCs含量的快速測定[37]。NIR法具有樣品預處理簡單，快速、無損的優點，但準確度不如經典分析方法，應用較少。

HPLC適用于極性強、不易揮發、熱不穩定組分分析，根據PCs不同組分在固定相和流動相中吸附或分配系數的差異達到分離的目的。該方法可串聯多種檢測器，包括二極管陣列檢測器(diode array detector, DAD)、紫外檢測器(UV detector, UVD)、四極桿質譜檢測器(MS)、三重四極桿質譜檢測器(MS/MS)等，可用于蓮中PCs單體組成及含量的檢測[5,9,21]，具有高效、精準等特點，是未來含量測定的理想方法，常采用C18色譜柱對PCs進行分離。童錫迪等[38]采用HPLC-DAD法測定蓮子殼提取物中PCs含量，樣品采用甲醇超聲提取后，進行水解反應，用Diamonsil C18柱分離，以V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)∶V(異丙醇)=13∶73∶8∶6為流動相洗脫分離，在525 nm下測定，該方法的線性范圍為37.6～300.8 μg/mL，加標回收率為99.2%，相對標準偏差為0.30%，檢出限和定量限分別可達16.6、50.5 μg/mL。由于PCs是一類性質極為相近的聚合物組成的混合物，受標準品的種類以及色譜分離能力的限制，HPLC只能分離PCs中十分有限的主要成分，很難對全部的PCs單體組成及含量進行測定。

3.2 結構分析技術

PCs的結構分析方法很多，包括電噴霧電離質譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)，HPLC-三重四桿串聯質譜(HPLC triple quadrupole tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)，HPLC-四極桿飛行時間質譜(HPLC quadrupole time-of-flight mass spectrometry, HPLC-QTOF-MS)，傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)，核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等方法[5,17-19,21,23-24]，由于PCs結構組分復雜，需借助多種手段才能解析其結構。在PCs結構分析中，對已分離純化的PCs可用MS的準分子離子、碎片離子和多種加合電荷離子等確定分子質量和分子式，利用FTIR確定特征官能團結構，利用NMR提供組成分子的碳氫骨架信息。LIU等[21]利用HPLC-DAD和HPLC-QTOF-MS分析蓮房中PCs組分構成，鑒定出11種PCs成分，均以C、EC、GC、EGC為組成單元，分別為EC/C、EGC/GC、B2/B3異構體、B1/B4異構體、A1/A2、(EC/C)-O-(EGC/GC)、(B1/B4)-(EC/C)、(EGC/GC)-(EGC/GC)、(B2/B3)-(EGC/GC)異構體、(B2/B3)-(EC/C)異構體和(EGC/GC)-O-(EGC/GC)-O-(EGC/GC)。此外，余修亮[23]利用FTIR技術在4 000～500 cm-1波段對蓮房和蓮殼提取物中PCs結構進行分析，圖譜顯示，3 423.5 cm-1處有吸收，判斷存在酚羥基，而1 616.2、1 447.5 cm-1處有吸收表明存在苯環骨架，此外，1 294.8、902.2 cm-1有吸收峰，表明有吡喃環構型。李綺麗等[39]采用大孔樹脂AB-8和聚酰胺柱對紅蓮外皮中PCs粗提取物進行純化，用IR、ESI-MS和HPLC-MS/MS進行成分分析，確認純化物中含有9種PCs單體和低聚體，其中包括C、EC(m/z289)、GC(m/z305)3種單體，4種原花青定二聚體同分異構體(m/z577)和2種原花青定四聚體同分異構體(m/z1 153)。

表4總結了蓮中PCs常用結構分析技術的原理及優缺點。在對PCs進行分結構分析時，應針對不同的目的選擇恰當的分析方法。

表4 蓮中PCs常用結構分析技術比較Table 4 The comparison of commonly used structural analysis techniques of PCs in lotus

4 蓮原花青素在食品中的應用

4.1 抑制食品油脂氧化

油脂是食品中主要的化學成分之一，在貯藏過程中油脂容易發生氧化，不僅影響食物感官，降低營養價值，還會產生一些過氧化物、醛類、酮類等有毒有害物質導致人體衰老、癌癥以及多種慢性疾病的發生。添加抗氧化劑是目前采取的抑制食品油脂氧化的主要手段。研究顯示，蓮原花青素可以很好地抑制脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)的活性[40]，當與金屬離子螯合后，對LOX活性的抑制能力更高[41]，從而有效抑制油脂的自動氧化，是一種優良的油脂天然抗氧化劑。李肖朋等[42]發現蓮原花青素低聚體(lotus oligomeric proantho cyanidins, LSOPC)可以延緩菜籽油的氧化，在添加量為0.05%的條件下，其抗氧化效果與合成抗氧化劑二叔丁基羥基甲苯相當，但是LSOPC酚羥基較多脂溶性較差，在油脂體系中的應用一定程度上受到限制。石嘉懌等[43]對LSOPC進行硬脂酰氯改性修飾，并對其在油脂儲藏及冷卻肉保鮮中的應用進行了研究。結果表明，經過硬脂酰氯改性，LSOPC脂溶性得到提高，更容易分散于油脂體系中，抗油脂氧化能力顯著增強，對冷卻豬肉的保鮮效果更佳，但在一定程度上會造成冷卻豬肉失色。李欣等[44]發現蓮房原花青素(lotus seedpod procyanidins, LSPC)能夠延緩冷鮮牛肉亮度值、紅度值、氧合肌紅蛋白含量的降低，抑制高鐵肌紅蛋白含量、酸價及硫代巴比妥酸值升高，顯著改善冷鮮牛肉色澤，抑制脂肪氧化，且當含量為0.08%時，護色和抗脂肪氧化效果最佳。此外，向面包中添加少量蓮原花青素，可以顯著增加面包清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的能力，提高面包的抗氧化活性，延緩淀粉在體內的消化速率，但會在一定程度上降低面包的比容，增加面包的硬度，使面包的食用品質受到影響[45]。

4.2 控制食品中有害物質生成

亞硝酸鹽(nitrite, NIT)是強致癌物N-亞硝胺前體，作為食品、尤其是腌制食品中人們高度關注的有害物質之一，控制其在食品中產生和含量是保證食品安全的重要環節。肖珍等[46]研究了LSPC對紫甘藍泡菜中NIT的抑制作用。他們在模擬發酵條件下測定了LSPC對NIT的清除率和對亞硝胺合成的阻斷率，發現LSPC對NIT清除率可達81.15%，對亞硝胺合成阻斷率可達80.29%。在發酵液中添加0.01% LSPC后，泡菜中NIT含量降低45.5%，表明LSPC通過阻斷亞硝胺合成，可顯著降低泡菜中NIT含量，同時發現添加LSPC能提高泡菜的抗氧化能力，保持紫甘藍泡菜中的還原糖和色澤，但會延長泡菜的發酵時間，降低泡菜的總酸含量。

食品在熱加工過程中不可避免地發生Maillard反應，即非酶促條件下羰基化合物和氨基化合物之間發生反應生成棕色甚至黑色物質，它在賦予食品誘人的色澤與風味的同時，也產生了丙烯酰胺(acrylamide, AM)、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products, AGEs)等有毒有害物質。研究顯示，LSOPC是AGEs天然抑制劑，在乳糖-賴氨酸體系中，LSOPC對AGEs生成具有抑制作用，而且受加熱溫度和時間影響顯著，其抑制機理可能為消除自由基、抗氧化、封閉活性羰基[47]。LSPC也被證明在抗AM生成方面具有顯著的效果。陳媛媛等[48]研究發現LSPC能有效抑制薯條、油條等油炸食品中AM的形成，當薯條和油條浸漬時間分別為90 s和60 s，LSPC添加量分別為0.5%(質量分數)和0.1%(質量分數)時，對AM的抑制率分別達到57.59%和67.38%，此時感官上與對照組并無顯著差別。LSPC對AM的抑制可能是因為其抗氧化性，通過抑制AM形成過程中主要的前體物質N-葡基胺的轉化，從而抑制AM的產生。而且LSPC對AM的抑制作用主要表現在抑制AM的形成過程，對生成后的AM并無抑制作用表現[49]。

4 總結與展望

經過多年的研究與探索，國內外關于蓮中PCs的組分構成、提取分離、檢測分析及在食品中應用等方面的研究取得了一定進展。從本文綜述可見，蓮中含有較豐富的PCs，以在蓮房中含量最高，且以B型二聚體為主。在提取分離蓮中PCs時，當前主要采用以乙醇溶液為提取劑的溶劑提取法和大孔樹脂吸附法，通過將不同方法適當組合結合能夠達到更理想的提取分離效果。在蓮中PCs含量測定方法中，以香草醛-鹽酸法和香草醛-硫酸法最為常用，但它們只能用于總量測定，無法有效測定PCs各單體含量，HPLC串聯不同檢測器可用于檢測PCs不同單體含量，且具有高效、精準等特點，是未來理想的含量測定方法，在結構分析方法中，很難通過單一方法實現PCs結構解析，需借助液相色譜質譜聯用、FTIR、NMR等多種方法才能解析得到可靠結果。此外，蓮原花青素具有天然抗氧化活性功能，能有效抑制食品油脂氧化，并對食品中NIT、AM、AGEs等有害物質形成具有抑制作用，在食品安全控制中展現出良好的應用前景。然而，目前對蓮中PCs的研究還存一些問題，主要表現在：蓮中PCs種類多、結構復雜，不易于結構表征，空間構型研究還不充分，不同組分間的活性差異研究亟待深入；提取分離純化工藝及含量測定研究尚不足，缺乏統一的技術標準；實際應用缺乏廣度和深度，產品開發仍處于初級階段；潛在的毒性危害仍然未知，需通過長時間的急性、慢性毒理學實驗進行評價。針對上述問題，未來應進一步加強對蓮中PCs提取分離工藝方面的研究，簡化生產工藝并提升得率水平，形成科學標準的檢測體系，探索并優化結構分析手段，明確蓮中更多PCs的空間構型，并對蓮原花青素進行系統開發和綜合利用，拓展應用廣度，提高應用深度，同時重視對蓮中PCs的毒理學研究，加強安全性方面的評價，確保其在實際應用中的安全性。此外，蓮中PCs含量有限，高原花青素的蓮種質資源的發掘也具有重要的研究意義和價值。因此，未來對于蓮中PCs的研究仍有大量的工作要做。