載P/Ag微結構Ti表面的生物學性能和抗菌性能

賈術峰，郝建華，李寶娥，王東輝，李海鵬，梁春永，王洪水

（河北工業大學 材料科學與工程學院，天津 300401）

0 引言

鈦（Ti）因其優良的強度/重量比、耐蝕性和生物相容性成為醫用臨床上廣泛使用的硬組織修復和替換材料，成功用作人工關節和牙科種植體等。但由于其不具有生物活性，植入肌體后不能與組織形成骨性結合，容易被纖維組織包裹，延長愈合時間，長期服役還可能出現植入物松動、脫落的現象。此外，鈦不具有抗菌性，植入肌體后引發術后感染的幾率為1%～4%，術后感染不僅嚴重影響植入物在體內的服役效果，而且加重患者的痛苦、提高了治療成本。因此，對鈦表面進行改性，賦予其良好的生物活性和抗菌性，對提高其綜合性能、改善臨床使用效果，具有重要意義。

成分和表面結構是決定材料表面性能的兩個重要因素。在過去的幾年中，研究者們采用各種物理和化學方法（如噴砂和酸蝕[1]、微弧氧化[2]、等離子噴涂[3]、陽極氧化[4]等）處理Ti表面以引入不同的微結構和化學成分，來提高其生物學性能和抗菌性。大量研究已表明，在Ti表面引入一定的微結構或者生物活性成分可有效改善其生物學性能，而各種有機、無機抗菌劑也常被引入到Ti表面以制備抗菌植入體。研究證實，P 可顯著提高植入材料的生物學性能，載P 植入體材料相比未載P 材料，其與骨組織的接觸增加率高達232%[5]。另外，銀是當前應用最廣泛的無機抗菌劑，已被安全應用于創傷外科手術中，可殺死多種細菌而不引起耐藥性[1]。因此，在具有微結構的Ti表面引入P和Ag有望提高其生物活性和抗菌性能，獲得良好的綜合性能。但如何將微結構與活性成分、抗菌成分同時引入到鈦表面，使其兼具良好的生物學性能和抗菌性能，是近幾年的研究熱點。

陽極氧化是在金屬表面制備可控微結構的常用方法，成本低、操作方便，并且由于陽極氧化層是由體材部分轉化而成，與致密體相之間沒有截然的分界面，可以具有高的結合強度和穩定性[6]。此外，在陽極氧化過程中，電解液中的生物活性成分也可通過反應過程中的動力學和熱力學梯度力引入到材料表面，進而改善材料的生物學性能[7]。因此，本研究首先利用陽極氧化技術將元素P和一種新型微結構引入到Ti表面，然后通過離心和紫外輻照的方法將Ag摻雜到該表面。本研究采用模擬體液（SBF）浸泡試驗考察材料的生物活性，MC3T3-E1細胞培養實驗研究其生物相容性，并采用細菌培養實驗評價其對大腸桿菌的抑菌效果。

1 材料和方法

1.1 樣品制備

采用TA1純鈦作為基體材料，線切割為10 mm×10 mm×1 mm的鈦片，然后用不同等級的SiC砂紙對其進行打磨，至表面光亮、無明顯劃痕后，再將鈦片依次放入丙酮、乙醇和去離子水中進行超聲清洗。隨后，將該鈦片置于含有1 mol/L NaF的42%（質量分數）磷酸電解液中進行陽極氧化處理。該陽極氧化處理采用可程控直流電源（WYK-1206，揚州），板狀高純石墨為陰極，鈦片為陽極，兩電極平行放置，間距為4 cm。其他實驗參數為：氧化電壓50 V，氧化時間1 h，反應溫度為室溫。反應結束后，鈦表面獲得載P的微結構陽極氧化層（命名為P-Ti）。然后將該樣品置于1 mol/L 的AgNO3溶液中進行離心處理，離心過程中轉速設置為8 000 r/min，離心時間為30 min，隨后再通過高壓汞燈進行紫外光照射30 min，以在Ti表面引入抗菌劑Ag，最終得到的樣品命名為Ag-P-Ti。

1.2 材料表征

分別采用掃描電鏡（SEM，HITACHI S-4800）和電子能譜儀（EDS）考察樣品的表面形貌和元素組成。采用X射線衍射儀（XRD，Rigaku D/max2500）測量樣品的物相組成，具體參數為Cu-Kα輻射、40 kV、40 mA，掃描角度為2θ=20°～80°，步長為0.02°。材料的表面粗糙度由原子力顯微鏡（AFM，Agilent 5500）進行測定，親水性通過用接觸角儀（KRUSS DAS30）在室溫下測量去離子水和樣品表面的接觸角來評估。

1.3 Ag 緩釋實驗

Ag的緩釋曲線測定方法如下：將載Ag樣品置于10 mL去離子水中，在37 ℃避光、靜置保存。在預定時間，取出樣品置于新的10 mL去離子水中，再次避光靜置保存。重復這一過程直至得到不同時間點的銀緩釋溶液。然后采用電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP-AES，PerkinElmer Optima 8300）測定溶液中Ag的含量，從而得到載Ag樣品在不同時間的Ag釋放量。

1.4 SBF 浸泡實驗

樣品的生物活性通過SBF浸泡實驗進行考察。SBF溶液與人體血漿的離子濃度非常接近，研究中通常以材料能否在SBF中誘導類骨磷灰石在其表面生成作為其是否具有生物活性的判據[8]。本研究中所用SBF為1.5SBF鹽溶液（離子濃度是SBF的1.5倍，并且保持了各離子之間的相對比例），以加速類骨磷灰石的形成過程，縮短實驗周期。將樣品浸泡于30 mL 的1.5 SBF中，在37 ℃下培養2周，然后，將樣品從溶液中取出，用去離子水輕輕沖洗，空氣中自然干燥后，通過掃描電鏡觀察樣品表面類骨磷灰石的形成情況。

1.5 細胞培養實驗

樣品置于高壓滅菌器中，在121 ℃下滅菌30 min，然后放入到24孔培養板中。將MC3T3-E1細胞（中科院上海細胞庫提供）以1×104cells/cm2的密度接種在樣品表面，于37 ℃、5%CO2培養箱中靜置1 h，待細胞充分黏附后，加入1 mL/孔的DMEM 培養液（Gibco），該培養液中含10%胎牛血清和3%青霉素鏈霉素，然后再置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中繼續培養1 d、3 d、5 d。用細胞增殖計數盒（CCK-8，Dojindo，Kumamoto，Japan）檢測細胞增殖情況。并將培養5 d的細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）沖洗后浸泡在2.5%戊二醛中固定過夜，隨后放置在不同等級的梯度乙醇中逐級脫水[9]，通過掃描電鏡觀察細胞形態。

1.6 細菌培養試驗

通過細菌培養實驗檢測樣品對大腸桿菌的抑制效果。將20 μL濃度為1×105cfu/mL的大腸桿菌溶液滴于樣品表面，37 ℃孵育24 h。培養結束后，用生理鹽水超聲清洗分離樣品表面的細菌。將鹽溶液中的細菌重新培養于瓊脂平板上24 h，觀察存活菌落數[10]。

1.7 統計分析

每個樣品進行3次實驗，所得數據偏差都用誤差棒表示。采用SAS軟件對數據的統計性進行分析，當p＜0.05時可認為差異有統計學意義。

2 結果與討論

圖1為Ti處理前后的表面形貌圖。可以看出，作為對照樣品的拋光Ti，表面相當光滑（圖1a）），經陽極氧化處理后，Ti表面形成了分布均勻、直徑為（120±30）nm的微孔層（圖1b）），EDS能譜證實該陽極氧化層上存在一定的P元素。進一步載Ag后，表面形貌沒有明顯變化，但在Ti表面可見一些細小的白色顆粒（圖1c））。在較高的放大倍數下，通過背散射掃描電鏡觀察（圖1c）右上），發現該白色顆粒均勻地分布于微孔中，表明抗菌劑Ag 被成功引入到P-Ti 表面的微結構中。EDS 能譜也測得P 和Ag 元素的存在（圖1d）），進一步證實樣品Ag-P-Ti的成功制得。

圖1 Ti 處理前后的表面形貌圖Fig.1 Surface morphology of the different Ti samples

然而，通過分析樣品的XRD譜圖，圖2所示，只檢測到了Ti的特征峰，這是由基體材料產生的。X射線衍射圖中P 和Ag 的缺失，表明它們的含量可能太少，無法檢測到。但是通過圖1 中EDS 分析結果及背散射圖片，可以證實一定量的P 和Ag 均已成功負載到鈦表面微納結構上。

圖2 Ag-P-Ti 樣品的表面XRD 圖譜Fig.2 XRD pattern of Ag-P-Ti samples

由于表面粗糙度和親水性是影響材料生物學性能的關鍵因素。本研究考察了不同樣品的表面粗糙度和親水性，如圖3所示。拋光Ti表面的粗糙度(Ra)約為（40±5）nm，陽極氧化后，表面粗糙度增加至（67±7）nm，進一步的Ag 加載過程對表面粗糙度沒有明顯影響。相應樣品的表面水接觸角分別為89°±2°、57°±5°和64°±3°。改性后的Ti表面比拋光Ti 表面具有更高的表面粗糙度和親水性，其原因是Ti 表面存在親水性的P 元素和多孔結構。與陽極氧化鈦表面（P-Ti）相比，Ag 加載的過程并沒有明顯改變表面粗糙度，這可能是由于負載的Ag顆粒尺寸細小且數量較低所致，然而，在Ag的加載過程中，表面張力和一些P會被部分釋放，從而導致表面自由能降低，親水性下降[1]。大量文獻證實，一定的粗糙度和良好的親水性有利于提高材料的生物活性和生物相容性[11]，因此，我們預計本研究中所制得的載P 和Ag 的多孔Ti 表面具有良好的生物學性能，能夠在SBF 中誘導類骨磷灰石形成，并加速細胞在該表面的黏附和增殖。

圖3 不同樣品的表面粗糙度和水接觸角Fig.3 Surface roughness and water contact angles of the different samples

將上述不同樣品在SBF中浸泡2周后，表面形貌如圖4所示。可以觀察到，拋光Ti表面浸泡前后沒有明顯的變化（圖4a）），而對于陽極氧化鈦表面（P-Ti）和載銀鈦表面（Ag-P-Ti），浸泡2周后均被一層類骨磷灰石均勻覆蓋，二者的表面形態沒有明顯的差異（圖4b）），證實Ti表面經改性處理后均具有良好的生物活性，加載Ag 不會破壞陽極氧化后Ti 表面的生物活性。基于文獻，改性Ti 表面的良好生物活性可歸因為，陽極氧化在Ti表面引入了親水性較好的P和微結構，良好的親水表面含有豐富的Ti-OH，使表面電荷為負，有利于鈣、磷離子的先后沉積，最終使得磷灰石在Ti表面成核和生成。SBF浸泡的實驗結果與文獻和我們之前的工作結論[11]相一致。

圖4 拋光Ti 樣品和Ag 負載Ti（Ag-P-Ti）樣品在SBF 中浸泡2 周后的表面形貌Fig.4 Surface morphologies of the polished Ti and Ag-P-Ti after immersion in SBF for 2 weeks

圖5a）顯示了細胞在不同樣品表面的黏附和增殖情況。與MC3T3-E1細胞共培養一段時間后，發現所有樣品均能促進細胞增殖。然而，多孔鈦表面上的細胞增殖速度明顯高于拋光鈦表面（p＜0.05），且陽極氧化Ti表面的細胞數量略高于Ag負載Ti表面的細胞數量（盡管統計差異不顯著）。不同樣品表面上細胞黏附和增殖的差異與圖3所示的樣品表面親水性很好地吻合，再次證實親水性的改善有利于細胞的黏附和增殖。觀察細胞形態發現，所有樣品表面均有利于細胞的黏附和鋪展，細胞形態無明顯差異。細胞呈典型的多角形狀，從細胞體中可見大量的指狀突起和絲狀偽足（圖5b）～d）），證實樣品表面均體現出良好的細胞相容性。抗菌劑Ag的加載未對細胞的黏附、鋪展和生長產生不良影響。據報道，過量的銀會破壞細胞內功能，引起細胞毒性，如何在植入材料表面控制適當的銀含量一直是研究的難題。在本研究中，加載的Ag顆粒沒有產生明顯的細胞毒性，這可能是由于材料表面的Ag含量和/或Ag的釋放速率較低所致。

圖5 MTT 法表征MC3T3-E1 細胞在不同Ti 表面的增殖情況及拋光Ti、P-Ti 和Ag-P-Ti 表面上的細胞形態Fig.5 MTT assay representing the MC3T3-E1 cell proliferation on different Ti samples,and cell morphologies on the polished Ti,P-Ti and Ag-P-Ti surfaces

圖6 顯示了Ag 的釋放量與浸泡時間的關系。可見第1 天樣品表面釋放的Ag 含量較高，隨時間延長，釋放量逐漸降低，到第3天時，銀的釋放量小于第1 天釋放量的一半。之后隨著時間的進一步延長，Ag 的釋放量減少更多，但2 周后仍能檢測到Ag 的釋放。有研究者指出，術后2周是植入物相關感染的高發期，因此，本研究中Ag 的釋放周期對于預防術后感染是適合的。此外，在實驗周期內，Ag 的總釋放量為10-6水平，證實了Ag 的含量和釋放率較低，不至于產生毒副作用，這也是載Ag 試樣具有良好生物活性（圖4）和細胞相容性（圖5）的原因。

圖6 Ag 的釋放量隨浸泡時間的變化（Ag-P-Ti）Fig.6 Ag release rate as a function of immersion time from Ag loaded Ti（Ag-P-Ti）

采用細菌培養實驗考察不同樣品的抗菌效果，菌落數圖片如圖7所示。可以看出，載Ag樣品上生長的菌落數量遠遠小于拋光Ti表面。而陽極氧化Ti表面和拋光Ti表面的菌落數沒有統計學差異。經24 h培養后，載Ag鈦表面對大腸桿菌的抑菌率高達99%以上，表明其具有良好的抗菌性。

圖7 拋光鈦和載Ag 鈦（Ag-P-Ti）表面的菌落數圖片Fig.7 The number of bacterial colonies grown on polished Ti and Ag loaded Ti（Ag-P-Ti）

對于Ag 納米顆粒的抗菌機制已有很多研究，通常認為它是通過與細菌細胞直接接觸，釋放Ag 離子，從而破壞細菌細胞膜、內部蛋白質和酶，導致細菌的死亡。Ag納米顆粒可以固定在細菌的細胞壁上，通過損傷細胞膜，使得細菌死亡。銀納米顆粒也可以穿透微生物細胞內部，與蛋白質相互作用，進而導致細胞功能障礙和細菌死亡。Ag納米顆粒和Ag離子均能產生高水平活性氧（ROS），從而抑制細菌細胞的呼吸和生長。

3 結論

1）成功在Ti表面制備了載有P和Ag的多孔微結構，Ag顆粒均勻分布在直徑120±30 nm的微孔中。

2）該載P和Ag的多孔微結構具有良好的生物活性和細胞相容性，其良好的生物學性能是由于引入的磷和多孔微結構改善了表面親水性。

3）該載P和Ag的多孔微結構中，Ag顆粒含量和釋放率都很低，沒有檢測到明顯的細胞毒性，但對大腸桿菌表現出良好的抗菌性能，且抗菌性能持續2周以上。