2018-2020年本院耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的產酶情況及耐藥性分析

劉敏娟 龐彩蓮 吳品 陳凱妮 黃嘉瑩

銅綠假單胞菌（PA）作為非發酵革蘭陰性菌之一，是臨床較為常見的條件致病菌，其感染的防治是一直是臨床工作的難點[1]，尤其是對于難治性PA，碳青霉烯類抗菌藥物仍然是優先考慮的用藥方向，隨著亞胺培南等碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，細菌產生一類能廣泛水解β-內酰胺類抗生素的碳青霉烯酶，包括絲氨酸酶和金屬酶，導致多重耐藥等現象日趨嚴重[2]，因此耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CRPA）的檢出越來越普遍。分析東莞市大朗醫院2018-2020年CRPA的產酶情況及其耐藥性，以及其臨床分布、標本來源、患者因素等，臨床根據藥敏試驗合理選擇抗菌藥物可防止CRPA的蔓延及傳播。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選自東莞市大朗醫院2018年1月-2020年12月，臨床住院及門診患者送檢標本檢出的465株PA，其中檢出CRPA 66株，包括痰液、血液、傷口分泌物、膿液、尿液等標本來源。同一患者重復株已經剔除。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗

嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行細菌的分離培養，使用法國生物梅里埃公司的VITEK2-Compact細菌鑒定儀和其系統配套的鑒定藥敏卡進行鑒定藥敏試驗，并采用紙片擴散法（K-B法）進行部分藥敏試驗的補充，抗菌藥物的補充紙片來自英國OXOID公司。藥敏試驗結果采用2021年CLSI M100標準判斷。

1.3 PA產碳青霉烯酶及其表型檢測

采用2018年CLSI推薦的eCIM試驗檢測CRPA是否產碳青霉烯酶[3-4]。取 10 μl純菌落于 2 ml TSB肉湯中，放入含10 μg美羅培南的無菌紙片，35 ℃孵育 4 h±15 min，制備 0.5 麥氏的大腸埃希ATCC 25922菌懸液涂布于MHA平板，將美羅培南紙片取出貼于MHA平板上，35 ℃孵育過夜后判讀結果，美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm，判斷碳青霉烯酶陽性，質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706。碳青霉烯酶表型檢測：采用紙片擴散法，制備0.5麥氏菌懸液，涂布于M-H瓊脂平板上，張貼4張亞胺培南（10 μg/片）藥敏紙片，紙片中心距離≥25 mm，在其中三張紙片上分別滴加10 μl EDTA 溶液、10 μl 3- 氨基苯硼酸溶液 10 μl EDTA溶液+10 μl 3-氨基苯硼酸溶液，35 ℃培養過夜后判讀結果。若含EDTA溶液抑制劑的亞胺培南抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，該菌株產生金屬β內酰胺酶，若含3-氨基苯硼酸抑制劑的亞胺培南抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，該菌株產絲氨酸酶。

1.4 質控菌株

大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853由廣東省臨床檢驗中心提供。肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705（產酶陽性株）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706（產酶陰性株）購買于溫州康泰公司。

1.5 統計學處理

同一患者重復分離菌株，僅取初次分離菌株進行分析。采用WHONET 5.6軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 標本來源構成

2018-2020年本院臨床送檢的標本共檢出465株銅綠假單胞菌，其中CRPA檢出率為14.2%（66/465），標本來源以呼吸道痰液為主，共43株，傷口分泌物6株，膿液5株，血液3株，尿液3株，其他分泌物1株，見表1。

表1 66株CRPA標本來源構成比

2.2 標本臨床分布

66株CRPA分布于重癥醫學科（ICU）16株、普通病房50株，CRPA科室檢出率排行前三的是：ICU 16株（24.2%）、呼吸內科13株（19.7%）、燒傷科10株（15.15%），具體分布情況見圖1。

圖1 66株CRPA在臨床科室分布構成

2.3 66株CRPA碳青霉烯酶表型檢測結果

66株CRPA碳青霉烯酶表型檢測結果中產碳青霉烯酶的構成比為33.3%，不產酶的構成比為66.7%，見表2。

表2 66株CRPA碳青霉烯酶表型檢測結果

2.4 66株CRPA耐藥率

66株CRPA的藥敏結果中亞胺培南和美羅培南的耐藥率較高分別為97.0%和71.2%，其次為氨曲南51.5%，其余耐藥率均＜30%，哌拉西林為27.3%，哌拉西林/他唑巴坦為22.7%，頭孢他啶16.7%，頭孢吡肟12.1%，環丙沙星12.1%，左旋氧氟沙星及氨基糖苷類耐藥率均＜10%，見表3。

表3 66株CRPA耐藥性分析結果[株（%）]

3 討論

PA是一種革蘭陰性的不發酵糖類的陰性桿菌，是臨床常見的條件致病菌，其具有易變異、定植、耐藥等特點，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，出現CRPA逐年增長。

從2018-2020年臨床送檢標本中共分離465株PA，其中CRPA 66株，檢出率14.2%，略低于2020年廣東省耐藥菌監測及質量控制中心的CRPA耐藥率數據（15.7%），高于余建洪等[5]結果（9.8%），低于2014-2019年全國細菌耐藥監測網細菌耐藥性監測報告中的CRPA檢出率為18.2%～21.0%[6]。本院CRPA檢出率均比全國水平低，這可能是與醫院級別相關、2020年疫情的影響門診及住院患者減少等原因相關。

在66株CRPA中，痰液標本43株，占65.2%，傷口分泌物6株，占9.1%，次之是膿液5株，占7.6%。標本來源以呼吸道痰液、傷口分泌物為主，與Guo等[7]研究結果一致，感染高發部位以呼吸道感染為主，這可能是與細菌含有莢膜多糖能抵抗吞噬細胞的吞噬，有利于致病菌黏附于呼吸道細胞表面、呼吸道與外界相通、菌群失調、患者免疫力下降、呼吸道樣本占比較高等相關[8]。在66株CRPA科室分布中，前三位是ICU 16株，占24.2%，呼吸內科13株，占19.7%，燒傷科10株，占15.2%。CRPA主要以重癥和慢性疾病患者為主。ICU患者具有病情危急危重、免疫功能低下、機械通氣使用頻繁、手術治療、住院時間較長、長時間使用青霉烯類抗生素或者聯合用藥等特點，有研究表明，入住ICU超過3 d的患者其CRPA的發生率會明顯增加[9]。呼吸科患者主要有基礎疾病、抵抗力較差、病情較長、年齡偏大等特點，加之同樣頻繁住院及大量廣譜抗生素的應用，使得感染概率也有所增加[10]。而燒傷患者因皮膚屏障功能遭受破壞，導致體內水分、蛋白質、電解質等的丟失，微生物可經燒傷創面侵入局部或全身引起感染，研究顯示，PA是燒傷患者醫院感染的最常見病原體之一[11]，尤其是燒傷重癥感染時，多選用具有抗菌活性較強、顯著的治療效果、對酶穩定性較高及不良反應較少的新型的β-內酰類的碳青霉烯類抗菌藥物，隨著臨床使用的日益頻繁，細菌耐藥性也有所增高，CRPA出現逐年上升的趨勢[12]。

在66株CRPA碳青霉烯酶表型檢測結果中，產碳青霉烯酶共22株，占33.3%，其中單一產絲氨酸酶為16.7%，單一產金屬酶為12.1%，同時產絲氨酸酶+金屬酶為4.5%，不產碳青霉烯酶為66.7%。本院中產碳青霉烯酶只是PA對碳青霉烯類耐藥的機制之一，不是對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制，與劉濤等[13]報道相似。這可能是PA固有耐藥性、外膜蛋白Opr-D2缺失、非特異外排泵高表達作用、外膜通透性降低等導致細菌耐藥。其次，不合理使用抗菌藥物及醫療機構感染預防與控制措施不當導致。

CRPA是指銅綠假單胞菌對碳青霉烯類亞胺培南或美羅培南任何一種藥物耐藥，亞胺培南耐藥率比美羅培南高，藥敏結果顯示，66株CRPA對亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為97.0%和71.2%，并且亞胺培南耐藥率高于美羅培南。這可能與PA對這兩種抗生素耐藥機制上不同所導致，PA對美羅培南的耐藥機制主要是以外排泵高表達為主，同時也受OprD基因下調影響[14]，而PA對亞胺培南耐藥機制更為復雜，除OprD基因突變和缺失為主外，產生最常見的金屬β-內酰胺酶也是其中之一，另外還存在外排泵高表達、產AmpC酶等耐藥機制[15]。另外也可能與藥物使用頻度有關，有研究表明，碳青霉烯類藥物的頻繁使用會對亞胺培南及美羅培南的耐藥率存在正相關[16]。其次為除氨曲南51.5%外，其余耐藥率均＜30%，哌拉西林為27.3%，哌拉西林/他唑巴坦為22.7%，頭孢他啶16.7%，頭孢吡肟12.1%，環丙沙星12.1%，左旋氧氟沙星9.1%，慶大霉素9.1%，妥布霉素9.1%，最低的耐藥率是阿米卡星4.5%，與王瓊瓊等[17]研究相近，因此阿米卡星可作為臨床治療CRPA的首選藥物。對于氨基糖苷類藥物耐藥率較低的原因可能是它與其他抗菌藥物相比不良反應較大，因此臨床使用率減少，從而降低耐藥性，其次是臨床上主要將它與β-內酰胺類藥物一起聯合使用，使其耐藥性的產生減慢[18-19]。

有研究顯示，目前導致CRPA的耐藥機制尚未明確，有可能與以下幾種原因相關：（1）CRPA能產生如β-內酰胺酶或氨基糖苷鈍化酶等抗菌活性酶。（2）CRPA可能改變抗菌藥物作用的靶位，如DNA旋轉酶等結構發生改變，達到逃避抗菌藥物的效果。（3）外膜通透性降低、生物膜形成及外源耐藥基因等[20-21]。

綜上所述，CRPA具有多種天然和獲得耐藥機制，且耐藥機制復雜，臨床治療非常困難，因此，臨床治療方案上應依據不同病區、不同感染來源，根據藥敏試驗合理選擇抗菌藥物進行個體化治療，可有效防止CRPA的蔓延及傳播。