ABCA1在卵巢癌中的表達及臨床意義

謝成茂，周 琦

卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系統惡性腫瘤，嚴重影響生命健康，但目前其發病機制仍不明確。脂肪酸是細胞代謝的能量貯存物質，在腫瘤細胞轉化及增殖過程中起到了重要作用，與卵巢癌的發生發展密切相關。ATP結合盒轉運體A1 (ATP binding cassette transporter A1, ABCA1)是1996年發現的一個脂質代謝相關基因，在體內脂質代謝過程中起到了關鍵的限速作用，與多種腫瘤關系密切。但是目前關于ABCA1與卵巢癌之間的關系并不清楚，國內外未見有相關文獻報道。本研究旨在探討ABCA1與卵巢癌之間的關系，為卵巢癌診治提供潛在的靶點及理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇北京婦產醫院2016-01至2020-12住院手術患者，選取卵巢癌106例作為卵巢癌組，良性卵巢上皮性腫瘤106例作為對照組。入選標準為：臨床診斷為卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤患者；年齡15～80歲，體重指數在19～25 kg/m，非素食患者；無手術禁忌。排除標準為：入院之前已行放、化療患者；伴其他系統惡性腫瘤患者；伴糖尿病及其他內分泌疾病以及嚴重的胃腸道、心肺及肝臟疾病患者。血液標本于次日晨收集4 ml空腹外周血用于血脂含量檢測；組織標本于手術切除后立即收集，其中一份固定于甲醛中制作石蠟切片，另一份保存于液氮中用于蛋白質的提取。所有患者術后均經病理科檢查證實。所取標本已與患者及家屬簽署知情同意書，且經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會審核通過。

1.2 材料 SDS蛋白提取液購自美國Invitrogen公司。小鼠抗人ABCA1及β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司，羊抗鼠二抗、BCA檢測試劑盒、免疫組化SP劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。其他Western-blot電泳和轉膜及封閉試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 血脂檢測 常規收集兩組患者空腹時肘靜脈血4 ml，4℃1000 r/min，離心5 min，吸取上層血清，加入 HVE-505400型全自動生化分析儀。采用CHOD-PAP法測定血液中總膽固醇(CHO)濃度，甘油激酶氧化法測定三酰甘油(TG)，一步法測定低密度脂蛋白(LDL)與高密度脂蛋白(HDL)。

1.4 免疫組化檢測ABCA1表達 采用SP法檢測卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤組織中ABCA1的表達情況。嚴格按照說明書進行操作，用PBS代替一抗作空白對照。ABCA1一抗稀釋濃度為1∶200，二抗稀釋濃度為1∶1000。以細胞質或細胞核呈棕黃色或棕褐色為陽性。

1.5 蛋白提取及Western-Blot檢測ABCA1表達 用SDS Lysis Buffer提取細胞總蛋白，用BCA法檢測總蛋白濃度，取20μg蛋白樣品與6×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液按5∶1比例混勻煮沸變性10 min，SDS-PAGE電泳，濕法轉膜，5%牛奶封閉2 h，一抗在4℃冰箱中搖晃孵育過夜、用PBS洗膜，二抗室溫孵育2 h、洗膜，化學發光法顯色，膠片曝光適當時間，經顯影、定影后，掃描讀取各組條帶灰度值進行統計分析。

2 結 果

2.1 臨床特征與脂質水平 兩組患者的年齡及BMI比較，差異無統計學意義(>0.05，表1)，具有可比性。卵巢癌組的血脂水平顯著低于對照組，差異有統計學意義(<0.05，表1)。

2.2 免疫組化檢測ABCA1在卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤組織中表達情況 免疫組化結果顯示ABCA1在卵巢癌及良性卵巢上皮性腫瘤組織中均存在表達，但在卵巢癌組織(圖1A)中表達量明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤組織(圖1B、C)，空白對照組(圖1D)中未見陽性表達結果。我們進一步用Western-blot檢測ABCA1在卵巢癌及對照組織中的表達情況。結果顯示，卵巢癌組的表達量(0.15±0.02)明顯高于對照組(0.06±0.01)，差異有統計學意義(<0.01，圖2)。

2.3 ABCA1表達與卵巢癌患者預后的關系 所有卵巢癌患者的中位隨訪時間是53.0個月[95%CI:(50.2～54.1)個月]。ABCA1陽性表達組的中位總生存期為48.0個月[95%CI: (45.9～51.5)個月]，其1、3、5年的總生存率分別是 100.0%、91.8%、54.1%。ABCA1陰性表達組的中位總生存期為57.0個月[95%CI:(54.7～58.9)個月]，其1、3、5年的總生存率分別是100.0%、 100.0%、 84.4%。 Kaplan-Meier生存曲線圖分析顯示，ABCA1陰性表達組患者的總生存率顯著高于陽性表達組(<0.01，圖3)。

3 討 論

癌細胞需要持續的能量供應以滿足其增殖、分化及侵襲，而癌基因則積極地調控體內能量代謝以提供能量。近些年來，脂質代謝異常逐漸被認為是惡性腫瘤細胞的一個共同特征，可為惡性腫瘤細胞增殖及轉移提供能量，同時提供細胞膜所需的組成成分和相應的信號調節傳導通路。研究證實脂質代謝的失調與癌癥的發生顯著相關，尤其是乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌及前列腺癌等。卵巢癌有轉移至大網膜的明顯傾向，而大網膜主要由脂肪細胞組成。與原發性卵巢腫瘤相比，大網膜轉移腫瘤瘤體組織中脂肪酸結合蛋白4(FABP4)表達上調，并在脂肪細胞-腫瘤細胞界面的卵巢癌細胞中檢測到FABP4的過表達。脂質代謝在卵巢癌發病過程中起到了重要作用，其中涉及到多種具有不同代謝功能、不同細胞定位或組織分布的異構體的代謝酶及多種不同的反饋機制等。卵巢癌患者血液中溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid, LPA)明顯升高，甚至在早期階段就出現異常，同時體外研究證實，LPA可以刺激卵巢癌細胞增殖、轉移及侵襲，在卵巢癌的發生發展過程中起到了重要的作用。我們研究證實，卵巢癌患者脂質代謝存在異常現象，其外周血中血脂含量明顯低于卵巢囊腫等卵巢良性腫瘤患者。這些研究表明脂質代謝異常在卵巢癌的發生發展過程中可能起到了重要的作用。

ABCA1是體內脂質代謝的關鍵基因，主要表達于細胞膜上，參與細胞膽固醇的轉運及免疫機制調控，長度為149 kb，含有50個外顯子，其cDNA包含6783個堿基，它編碼的蛋白質分子量為254 kDa，由2261個氨基酸組成。我們對ABCA1在卵巢癌組織中的表達情況進行分析，發現卵巢癌組織中ABCA1的表達量顯著高于良性卵巢上皮性腫瘤，并且ABCA1的表達與卵巢癌患者的預后負相關，即ABCA1陽性表達的卵巢癌患者其預后較ABCA1陰性表達患者更差。ABCA1屬于ABC超家族中的一員，是跨膜蛋白的一種，包含兩個跨膜結構、一個跨膜的調節結構域及兩個核苷酸結合結構域。在正常細胞中，ABCA1主要是將細胞內的游離膽固醇、磷脂轉移至細胞外并與載脂蛋白A-1 (apoA-1)結合，形成扁平高密度脂蛋白(HDL)，后者再接受游離膽固醇和磷脂形成成熟HDL，在維持細胞膽固醇穩態中的正常作用已得到證實。在癌細胞中，ABCA1的作用尚不清楚，但其所調控的膽固醇是細胞膜的重要組成部分，對腫瘤細胞的快速生長和分裂及遷移具有限速作用，可影響細胞間信號轉導和藥物敏感性。ABCA1敲除后對細胞生長和遷移起到了明顯的抑制作用，同時在卵巢癌細胞系和卵巢癌患者組織樣本中觀察到ABCA1啟動子甲基化，并且發現ABCA1高甲基化的卵巢癌患者生存期明顯縮短。卵巢癌發病過程中ABCA1被高甲基化與卵巢癌患者的預后不良相關，ABCA1在這個過程中可能起到了促進腫瘤發生發展的作用。

綜上所述，脂質代謝與卵巢癌的發病密切相關，在其發生發展過程中起著重要作用。而作為脂質代謝的關鍵基因ABCA1，在卵巢癌中存在異常高表達，并可影響卵巢癌患者的預后，其可能通過調控體內脂質代謝而參與卵巢癌的發生發展。然而，目前關于ABCA1在卵巢癌發生發展過程中的確切作用機制尚不明確，需要我們在后續研究中進一步深入的探索。