結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測方法的研究進展

奚少勇，磨立達

〔南寧市第四人民醫(yī)院，廣西艾滋病臨床治療中心（南寧）檢驗科，廣西 南寧 530023〕

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)重要的傳染病。耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)給結(jié)核病的防治帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織（WHO）于2013 年重新修訂了耐藥結(jié)核病的分類（主要分為以下五類：單耐藥結(jié)核病、多耐藥結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病和利福平耐藥結(jié)核病）[1]。2020 年，WHO就全球結(jié)核病(TB) 進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)顯示，2019 年全球新增結(jié)核病患者996 萬例，約有3.3% 的新患者和18% 的復(fù)治患者對RFP 耐藥，估算利福平耐藥結(jié)核病患者數(shù)約有46.5 萬，其中耐多藥結(jié)核病患者約占78%。我國的耐藥結(jié)核病（DR-TB）患者數(shù)約為6.5 萬，占全球的14%，相關(guān)疾控形勢相當嚴峻[2]。我國每年花費大量的資金用于治療DR-TB，但效果不夠理想，患者的死亡率較高（死亡病例數(shù)幾乎是全球結(jié)核病死亡病例數(shù)的四分之一），近年來不少菌株對貝達喹啉（Bbq）、德拉馬尼（Dlm）等新藥逐漸發(fā)生耐藥，甚至達到了無藥可用的地步[3]。耐藥結(jié)核病的診斷主要以MTB DST 檢測結(jié)果為依據(jù)。在本文中，筆者主要是對各種MTB DST 檢測方法的研究進展進行綜述。

1 表型DST 檢測方法

當前，業(yè)內(nèi)一致認同MTB 耐藥性檢測必須依賴于MTB 培養(yǎng)。MTB 培養(yǎng)主要是利用絕對濃度法或比例法將菌株接種于含抗結(jié)核藥及不含藥的羅氏培養(yǎng)基上，根據(jù)培養(yǎng)基表面覆蓋菌落數(shù)量或無菌落情況判斷培養(yǎng)菌株是否產(chǎn)生耐藥性。另外，也可利用菌株在含藥和不含藥液體培養(yǎng)基中的生長情況來判斷其是否產(chǎn)生耐藥性。此方法可同時檢測其對多種藥物的耐藥性，包括一線及二線抗結(jié)核藥。然而，檢測表型DST 需使用MTB 純培養(yǎng)物，且MTB 存在生長較慢、有生物安全危害性的特性，這決定了該檢測方法存在費時、成本高、可比性差等缺點[4]。另外, 在培養(yǎng)異質(zhì)性耐藥菌株時，敏感菌比耐藥菌生長快，這可能會引起耐藥漏判。

1.1 傳統(tǒng)的表型DST 檢測方法

目前臨床上常用的表型DST 檢測方法主要包括絕對濃度法和比例法，用這兩種方法檢測MTB耐藥性的相符性均達80% 以上，檢測RFP 耐藥性的相符性可高達90%。研究表明，在對MTB耐藥的檢出率方面，比例法優(yōu)于絕對濃度法。上述傳統(tǒng)DST 檢測方法的優(yōu)勢是可同時檢測十幾種抗結(jié)核藥物的耐藥水平、有商業(yè)化的試劑、操作簡便、檢測費用低，適于在縣級疾控中心或縣級定點醫(yī)院開展。但其同時存在較多缺點，包括檢測EMB、吡嗪酰胺(PZA)、Pto、PAS 和Cs 的結(jié)果不穩(wěn)定、耗時長（培養(yǎng)時間通常在30 d 以上）、檢測結(jié)果易受含藥管中實際藥物濃度、MTB 懸液濃度、接種量和MTB 活力的影響等。

1.2 分枝桿菌液體培養(yǎng)DST 檢測法

采用分枝桿菌液體培養(yǎng)DST 檢測法檢測MTB耐藥性的結(jié)果與傳統(tǒng)表型DST 檢測方法具有較高的符合性，但檢測時間較短（通常需要8 ～10 d）[5]。WHO 已認可應(yīng)用該法進行部分二線抗結(jié)核藥物〔如氧氟沙星(Ofx)、Km、Cm、Eto 等〕MTB DST檢測的效果[6]。其缺點是檢測儀器和試劑較為昂貴，且易被污染[7-8]。其優(yōu)點包括可肉眼、自動化判讀結(jié)果等[9]。

2 分子DST 檢測方法

分子DST 檢測目前已被公認為是DR-TB 的確診項目之一[10]，其優(yōu)點是檢測時間短(2 ～48 h)、敏感度高，能從MTB 分離株、預(yù)處理的涂陰或培陰臨床標本中檢出MTB 耐藥基因突變。需要注意的是，在進行相關(guān)標本處理或分離株前處理時存在較高的生物安全風險，但在進行標本液化時和完成DNA 提取后，安全風險是很低的。此檢測方法的其他缺點包括：1）檢測僅限于部分耐藥基因型，應(yīng)用范圍受限[11]；2）難以檢出異質(zhì)性耐藥[12]，表型DST 低水平耐藥菌株可能無法被檢出；3）會檢出不影響耐藥表型的同義突變( 氨基酸無改變)、沉默突變( 不影響編碼蛋白的表達)[13]，產(chǎn)生假陽性結(jié)果（但這種情況的發(fā)生概率很低）；4）無法檢出所有表型的MTB 耐藥菌株[14]；5）檢測成本較高。可見，此檢測方法無法替代傳統(tǒng)的表型DST 檢測方法，僅可起到一定的補充作用。

2.1 實時熒光定量PCR 技術(shù)

采用實時熒光定量PCR 技術(shù)進行DST 檢測具有檢測時間短、自動化程度高，既能檢測MTB 基因，又能辨別RFP 常見耐藥決定區(qū)域[15]，檢測可信度高等優(yōu)點。在進行該檢測時，核酸片段提取、變性退火延伸、檢測分析產(chǎn)物等步驟均能實現(xiàn)自動化，操作不繁瑣，檢測所需時間在100 min 左右。可直接對固體或液體培養(yǎng)物進行檢測，除血液標本外，其他臨床標本（如痰、固/ 液培養(yǎng)物、肺外結(jié)核標本）均可檢測。其傳染風險低，產(chǎn)生氣溶膠的幾率小。但目前只能檢測RFP 的耐藥性，并不能區(qū)分具體的突變類型。

2.2 熒光PCR 探針熔解曲線法

采用熒光PCR 探針熔解曲線法可檢測MTB對多種抗結(jié)核藥物（如異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇及氟喹諾酮類藥物）的耐藥性[16]。其優(yōu)點是操作簡便、檢測時間短。其缺點是檢測結(jié)果易受到探針GC 含量、金屬離子濃度、雜交溫度等多種因素的影響，且不能區(qū)分具體的突變類型。

2.3 基因芯片技術(shù)

采用基因芯片技術(shù)能快速、準確地檢測出MTB 對利福平及異煙肼的耐藥性。此技術(shù)可用于鑒別各種分枝桿菌[17]。有研究指出，利用基因芯片技術(shù)能夠快速檢出MTB 對RFP 和INH 耐藥的常見基因型，并可明確突變的具體位點和性質(zhì)。進行相關(guān)檢測的耗時僅為1 ～2 d。大量的研究表明，此技術(shù)在診斷MDR-TB 中的應(yīng)用價值較高。其缺點是進行雜交、檢測過程中的工序繁瑣，所需技術(shù)熟練程度較高，且試劑較貴。

2.4 反向雜交技術(shù)

利用反向雜交技術(shù)可同時快速檢測MTB 對RFP、INH、EMB、FQs、Am、Km 和Cm 的 耐藥性[18]，明確相關(guān)基因突變的具體位點和性質(zhì)，并可對MDR-TB、pre-XDR-TB 和XDR-TB 進行鑒別診斷。進行相關(guān)檢測的耗時僅為1 ～2 d。但由于其屬于開放性檢測，容易產(chǎn)生氣溶膠，且雜交、顯色過程操作繁瑣，不易控制。

2.5 基因測序技術(shù)

利用基因測序（whole-genome sequencing,WGS）技術(shù)能夠高效便捷地檢測出MTB 對RFP和INH 的耐藥基因型，明確相關(guān)基因突變的具體位點和性質(zhì)，從而能夠為精準診療提供有益參考。但進行相關(guān)檢測的準入成本較高，經(jīng)驗及技術(shù)人員相對缺乏[19]，目前在基層、乃至多數(shù)地市級定點醫(yī)院尚無法廣泛開展。

3 小結(jié)

目前，無論是表型DST 檢測方法還是分子DST 檢測方法，均無法單一滿足臨床需求。低濃度MTB 易導(dǎo)致表型DST 檢測與分子DST 檢測的結(jié)果不一致。用表型DST 檢測方法和分子DST 檢測方法檢測RFP、INP、FQs 抗結(jié)核耐藥性的準確度較高，其他藥物的DST 檢測需結(jié)合臨床。表型DST 和分子DST 對二線抗結(jié)核藥物的DST 檢測結(jié)果均不穩(wěn)定。傳統(tǒng)表型DST 檢測是檢測MTB 的金標準，但也有其局限性。分子DST 檢測可作為快速篩查MTB 的方法和（或）傳統(tǒng)表型DST 檢測的補充。采用多種方法聯(lián)合檢測能提高MTB 的檢出率、縮短診斷時間，但會增加TB 患者的檢測費用。《結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測專家共識》[20]中提出了一種進行MTB 耐藥性檢測的策略( 見圖1)，旨在為DR-TB 的早期明確診斷及治療提供實驗室依據(jù)。

圖1 一種進行MTB 耐藥性檢測的策略

綜上所述，對于疑似DR-TB 患者，臨床上應(yīng)選擇合適的DST 方法對其進行耐藥性聯(lián)合檢測。相關(guān)研究人員應(yīng)努力尋找更有效的MTB DST 檢測方法，以便為DR-TB 的快速、準確診斷和早期有效治療提供可靠的實驗室依據(jù)。