人源TNF-α蛋白生物信息學分析及相關治療思路研究*

蹇艾利，申元英，姜石松，2△

(1.云南大理大學基礎醫(yī)學院微生物學及免疫學教研室，云南 大理 671000；2.英國牛津大學腫瘤系，英國 牛津 OX3 7DQ)

腫瘤壞死因子(TNF)是一種多功能細胞因子，既能促進細胞增殖，引起炎性反應；也能殺傷腫瘤細胞[1-2]。TNF由多種細胞分泌，但主要是巨噬細胞和T淋巴細胞，其中單核-巨噬細胞分泌的為TNF-α，也是通常說的TNF；活化T淋巴細胞分泌的淋巴毒素也稱為TNF-β。TNF-α是炎性反應中水平最先升高的細胞因子，因被發(fā)現(xiàn)其具有誘導實驗性癌癥快速出血性壞死的能力而命名，對機體生理和病理均有著深刻而多樣的影響[3]。TNF-α作為巨噬細胞分泌的多功能細胞因子，在本身具有系統(tǒng)性炎性反應作用的同時，還可作為調(diào)節(jié)免疫細胞誘導其他炎性細胞因子的表達[4]。在發(fā)現(xiàn)TNF-α之初，人們以為發(fā)現(xiàn)了對抗腫瘤的重磅治療手段，然而后來的研究卻發(fā)現(xiàn)TNF-α不僅不能用于體內(nèi)腫瘤治療，反而會引起敗血癥休克及其他許多急、慢性炎癥。TNF-α作為TNF超家族中體現(xiàn)生物學活性的主要成員，參與了多種炎癥性疾病[5-6]。關于TNF-α的前期研究表明，TNF-α與不同TNF受體結合后會發(fā)揮不同的生物學效應[7]。常見的TNF-α抑制劑包括英夫利昔單抗、阿達木單抗、依那西普和戈利木單抗，通過與TNF-α的高親和力阻斷其與受體的相互作用，進而達到抑制炎性反應的作用[8]。然而，目前對TNF-α的研究大部分聚焦于其作用與信號通路，鮮有相關生物信息分析，并且適當?shù)腡NF-α與受體相互作用有助于體內(nèi)炎癥介質的清除，因此，根據(jù)對人源TNF-α的生物信息學分析找到新的藥物設計靶點至關重要。

1 材料與方法

1.1材料 在Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索并下載人源TNF-α的蛋白質序列(登錄號為P01375)獲取人源TNF-α蛋白氨基酸序列。

1.2方法

1.2.1人源TNF-α蛋白質理化性質分析 通過Expasy在線預測網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protparam/)預測人源TNF-α蛋白理化性質。

1.2.2預測信號肽、跨膜結構及亞細胞位置 利用在線數(shù)據(jù)庫TMHMM Server V2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析人源TNF-α跨膜結構域；利用在線數(shù)據(jù)庫SignalP-5.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預測該蛋白的信號肽序列；利用在線數(shù)據(jù)庫Cell-Ploc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-Ploc-2/)預測人源TNF-α蛋白的亞細胞定位。

1.2.3人源TNF-α蛋白空間結構分析 利用PRABI數(shù)據(jù)庫中的SOPMA(https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin，secpred sopma.pl)進行蛋白質二級結構的預測；利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive#sequence)在線預測網(wǎng)站對蛋白質的三級結構進行預測。

1.2.4疏水性預測 利用在線數(shù)據(jù)庫Protscale的Hopp&woods算法預測人源TNF-α蛋白的疏水性。

1.2.5人源TNF-α蛋白磷酸化位點預測 登錄“http：//www.cbs.dtu.dk/services/netrhos/”網(wǎng)站對蛋白磷酸化位點進行預測。

1.2.6人源TNF-α蛋白相互作用蛋白分析 采用String在線軟件分析蛋白的相互作用。

1.2.7人源TNF-α蛋白抗原表位的預測 利用IEDB數(shù)據(jù)庫預測人源TNF-α的優(yōu)勢B細胞表位。

2 結 果

2.1人源TNF-α蛋白理化性質 人源TNF-α相對分子質量為26×103，理論等電點為6.44，分子式為C1152H1825N313O337S6。共編碼233個氨基酸，其中丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸含量較高，分別占8.15%、12.88%、8.58%。見表1。帶負電荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)殘基數(shù)目為23個，帶正電荷的氨基酸(精氨酸+賴氨酸+組氨酸)殘基數(shù)目為26個，疏水性氨基酸殘基數(shù)目為123個。不穩(wěn)定系數(shù)為40.75(為不穩(wěn)定蛋白)。脂肪系數(shù)為98.87，親水性平均系數(shù)為-0.047(為親水性蛋白)。預測半衰期在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞體外約為30 h，在酵母內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌內(nèi)大于10 h。

表1 人源TNF-α蛋白氨基酸組成(n=233)

2.2信號肽、跨膜結構域及亞細胞定位 該蛋白信號肽結果顯示可能性為0.000 7，可推斷不是分泌蛋白。預測人源TNF-α蛋白擁有一個跨膜區(qū)，推測位于第35～57個氨基酸區(qū)間，位于N端。第1～34個氨基酸位于膜內(nèi)，第58～233個氨基酸位于膜外。TNF屬于Ⅱ類跨膜蛋白，C端位于細胞外，并且含有較多疏水性氨基酸，主要構成TNF活性三聚體的β-片層的中間鏈，是參與維持TNF立體結構的重要物質；而N端位于細胞內(nèi)含有較多親水性氨基酸，是TNF與TNF受體(TNFR)相互作用的部位。TNF具有兩種形式，一種是相對分子質量為26×103的膜型TNF，在細胞膜上與細胞共同發(fā)揮作用刺激免疫細胞；另一種是相對分子質量為17×103的可溶型TNF，是通過TNF轉換酶對膜型TNF進行酶促裂解而形成的，在血液中結合TNFR1發(fā)揮作用，與本課題組前期研究結果相符[9]。預測該蛋白亞細胞定位在細胞膜上。見圖1。

2.3人源TNF-α蛋白空間結構 人源TNF-α氨基酸序列中α-螺旋結構有73個氨基酸，占二級結構總數(shù)的31.33%；β-折疊結構有60個氨基酸，占二級結構總數(shù)的25.75%；β-轉角結構有17個氨基酸，占二級結構總數(shù)的7.30%；無規(guī)則卷曲結構有83個氨基酸，占二級結構總數(shù)的35.62%。運用SWISS-MODEL在線建模分析人源TNF-α三級結構。該模型全局模型質量估計評分為0.61分，所得模型質量良好，結構分析為同源性三聚體蛋白。見圖2。

2.4人源TNF-α蛋白親/疏水性、磷酸化位點及相互作用蛋白網(wǎng)格 人源TNF-α蛋白含有多個親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域，其分布聚集不明顯。人源TNF-α蛋白有15個絲氨酸磷酸化位點，6個蘇氨酸磷酸化位點，3個酪氨酸(磷酸化位點)。其中第151～200個序列中磷酸化位點最多，推測此處可能為重要功能區(qū)域，與本課題組前期研究證明該區(qū)域屬于功能片段相符[9]。與人源TNF-α蛋白有相互作用的蛋白分別為TNFAIP3、RIPK1、BIRC2、TRAF2、FADD、TRADD、IKBKG、TNFRSF1A、TNFRSE1B、IL-10等，與人源TNF-α相互作用的具體機制具有重要意義。見圖3。

2.5人源TNF-α蛋白優(yōu)勢抗原表位 共有7個優(yōu)勢表位，分別位于第7～27、55～87、97～114、142～150、160～166、175～190、213～223區(qū)間。見圖4、表2。7個優(yōu)勢表位可為后期設計針對人源TNF-α藥物、多肽提供靶點。

表2 人源TNF-α 蛋白刺激B細胞優(yōu)勢表位氨基酸序列

3 討 論

對TNF-α的研究由來已久，但主要集中于TNF-α的產(chǎn)生、作用及相關信號通路方面，少有關于TNF-α生物信息學分析。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α之所以能誘導多種生物學功能主要是來自于3個重要的細胞內(nèi)事件：(1)刺激核因子κB (NF-κB)活化；(2)誘導細胞凋亡；(3)誘導細胞壞死[9]。

3.1三聚體TNF-α的促炎性作用 TNF-α是炎癥過程中最早出現(xiàn)的炎癥介質，當TNF-α結合TNFR1后活化下游一系列蛋白激酶，降解NF-κB抑制因子激酶，激活NF-κB信號通路，產(chǎn)生更多的細胞因子，促進細胞增殖；經(jīng)NF-κB活化誘導產(chǎn)生的蛋白，如促炎性細胞因子TNF-α又再次活化NF-κB，這樣就產(chǎn)生了一種擴大炎性反應的惡性循環(huán)。當發(fā)生急性炎癥時，TNF-α趨化至局部炎性病灶，并且刺激其他炎性細胞因子的產(chǎn)生，加速對病原體的清除；當TNF-α等炎癥介質擴散到全身時細胞因子網(wǎng)絡形成正反饋，多種免疫細胞被激活，不斷產(chǎn)生更多的促炎性細胞因子，形成“瀑布效應”，易造成全身多處器官衰竭而導致死亡。

3.2TNF-α衍生肽P16、P1516的促壞死作用 此前本課題組已證實一些TNF-α衍生的保守肽段可誘導細胞凋亡和(或)壞死，并且不依賴于與TNFR結合的直接殺傷模式。TNF-α衍生肽P16、P1516通過破壞細胞膜完整性而引起壞死，其中P16可直接殺死人膠質母細胞瘤細胞、原發(fā)性肝癌細胞和腎癌細胞，P1516因其具有獨特的二級結構可通過誘導血管和淋巴管損傷抑制腫瘤在體內(nèi)的生長和轉移，從而提高存活率[10]。這些壞死誘導肽作為TNF-α的降解產(chǎn)物，其殺傷癌細胞和抑制腫瘤轉移的能力可能會成為癌癥治療的新靶點。

3.3TNF-α衍生肽P1213的促凋亡作用 有研究表明，只有當NF-κB信號通路被抑制時TNF-α的促凋亡/壞死作用通路才會被激活[11]。如NF-κB沒有被激活，TNF-α會刺激靶細胞在細胞質中形成復合物Ⅱ，與復合物Ⅰ比較，復合物Ⅱ缺少了TNFR1和細胞凋亡抑制因子-1，但增加了FADD、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)和caspase-10，其中caspase-8、caspase-10能活化效應物caspase-3、caspase-6、caspase-7，并使之穿透細胞膜，在caspase激活的脫氧核糖核酸酶作用下切碎細胞核，促進細胞凋亡。作者發(fā)現(xiàn)，TNF-α衍生肽P1213可能通過能量依賴途徑進入細胞，直接與TRADD結合，隨后與復合物Ⅱ作用，激活caspase-3，最后引起凋亡。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)以這些衍生肽作為潛在的藥物靶點或治療用劑奠定了基礎。

因人們認識到利用重組TNF-α治療癌癥時的治療指數(shù)非常小，甚至可誘導類似于內(nèi)毒素休克的體征和癥狀的細胞因子風暴，所以，不能將大量的TNF-α用于抗癌治療中。此外有大量研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中TNF-α是引起癌癥相關炎癥的主要介質[3，12-14]。在癌癥領域以外，TNF-α被認為是炎癥的主要調(diào)節(jié)因子和細胞因子網(wǎng)絡的重要角色，無論是促進腫瘤細胞生長還是抵抗腫瘤細胞生長，TNF-α均是一個重要的檢測指標[3]。TNF-α是炎性反應過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎癥介質，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細胞因子的合成和釋放。對TNF-α的作用如不加以調(diào)節(jié)會引起慢性炎癥和全身性消耗，當機體處于急性炎癥反應狀態(tài)時，大量產(chǎn)生的TNF-α會進入全身循環(huán)會引起敗血性休克[15]。所以，對是否在正確的時候、正確的環(huán)境下產(chǎn)生適量的TNF-α是至關重要的，將TNF-α的產(chǎn)生限制于某一特定局部組織可能是控制其有益功能的機制之一[16]。由于蛋白質在進化過程中其保守的序列通常具有功能重要性，有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α的某些氨基酸序列可能在不同物種中保持不變，并且不同的氨基酸序列發(fā)揮不同的功能[9]。有研究證實，當TNF-α以三聚體形式存在時可激活NF-κB促進細胞增殖，裂解為線性多肽時單獨肽P12和結合肽P1213可發(fā)揮誘導細胞凋亡的功能；單獨肽P15和結合肽P1516可發(fā)揮誘導細胞壞死的功能，并且這些肽段并沒有通過TNFR1促進細胞死亡，而是直接破壞細胞膜。利用這些保守肽段的細胞毒性作用可能為癌癥治療方法提供新靶點，并且加強對體內(nèi)TNF-α抗體的研究可能會為由TNF-α升高引起的細胞因子風暴提供治療策略。