HPLC法測定二氧化氯乳頭消毒劑中乳酸的含量

王歡歡，劉 靜，張靖菊，徐 飛

(國家飼料藥物基準實驗室，中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081)

乳酸是一種天然的有機酸，是重要的抗菌化合物[1]，屬于消毒防腐類藥，是公認安全的GRAS(Generally recognized as safe，GRAS)添加劑[2]，廣泛應用于飲食業(yè)、化妝品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和畜牧業(yè)等行業(yè)中[3]。乳酸主要有三種構型[4]，分為D型、L型和DL型，由于D-乳酸、DL-乳酸對人體有一定的毒副作用，所以與飲食業(yè)相關的乳酸構型為L型。乳酸能抑制真菌的生長[5]，有助于農副產品的保存。有研究表明[6-8]，乳酸對部分革蘭氏陽性菌、部分革蘭氏陰性菌和部分真菌都有殺滅和抑制作用，其對致病菌主要是通過延長代時和破壞正常細胞膜電位來達到抑菌及殺菌作用[9]。乳酸作為原料藥收錄于2020版《中國藥典》中[10]，與水溶液顯酸性，含量測定方法為滴定法，范圍為85%～92%(g/g)。文獻報導的乳酸的含量測定方法有高效液相色譜法[11]、液質聯(lián)用技術[12]、離子色譜法[13]、氣相色譜法[14]等。液質聯(lián)用技術、離子色譜法和氣相色譜法測定乳酸均具有局限性，與高效液相色譜法相比操作復雜且成本較高。乳酸具有熱不穩(wěn)定性，在高溫下易分解[15]，用氣相色譜法測定時，需將極性強的乳酸衍生化為極性弱的酯化物[16]，處理過程較為復雜且耗時較長。本文擬建立HPLC法測定二氧化氯乳頭消毒劑中乳酸的含量，并對其色譜條件進行耐用性試驗，驗證其可靠性，可作為該乳頭消毒劑中乳酸的含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(Waters 2695，配2487紫外檢測器)，美國Waters公司；超純水一體化系統(tǒng)，美國Pall公司；電子天平(萬分之一)，德國Sartorius公司；針式過濾器(有機系)(0.22 μm)，天津市津騰實驗設備有限公司；微孔過濾膜(有機系)(0.22 μm)，美國Waters公司；二氧化氯乳頭消毒劑(其中乳酸含量2.4%)，中國農業(yè)科學院飼料研究所國家飼料藥物基準實驗室自主研發(fā)；乳酸原料藥(含量85%)，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸對照品(含量89.9%)，德國Ehrenstorfer GmbH公司；磷酸為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈為色譜級純，美國Fisher公司。

1.2 色譜條件 色譜柱：資生堂Capcell Pak C18MG(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.1%磷酸水溶液-乙腈=97.5∶2.5，V/V；檢測波長：215 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.3 溶液配制 對照品溶液的配制：精密稱取乳酸對照品適量，加水溶解并稀釋制成質量濃度為10 mg/mL的溶液，作為對照品儲備液。精密移取乳酸對照品儲備液適量，加水稀釋制成500 μg/mL的乳酸溶液，作為對照品工作液。

供試品溶液的配制：取充分混勻后的本品適量(約相當于乳酸50 mg)，精密稱量，置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度線，振蕩提取1 min。精密移取1 mL提取液置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品工作液溶液。

1.4 方法參數(shù)考察和耐用性試驗 參照2015版《中國獸藥典》附錄0512，對系統(tǒng)適應性、線性、靈敏度、精密度、準確度、溶液穩(wěn)定性及方法耐用性試驗進行了考察和研究。

2 結果與分析

2.1 系統(tǒng)適應性 如圖1所示，對照品和供試品乳酸保留時間分別為4.313和4.318 min，對照品工作液中乳酸主成分峰與相鄰色譜峰完全分離，USP拖尾因子為1.05，USP理論塔板數(shù)為18739，連續(xù)進樣6針后，主峰峰面積RSD為0.35%，小于2%，符合標準。

圖1 色譜圖(500 μg/mL乳酸對照品(A)；500 μg/mL乳酸供試品(B)；空白輔料(C)；空白輔料-500 μg/mL乳酸對照品(D))

2.2 線性關系考察 精密移取對照品儲備液適量，用水稀釋成200、400、500、600、800、1000 μg/mL的系列濃度溶液，按1.2項下色譜條件進樣，以濃度為橫坐標，乳酸峰面積為縱坐標，得出標準曲線回歸方程為：Y=536X+3280，決定系數(shù)R2=0.9999，顯示該方法的線性良好。乳酸標準曲線如圖2所示。

圖2 乳酸峰面積-濃度標準曲線圖

2.3 靈敏度 采用逐步稀釋的方法，按信噪比S/N≥3，得出檢測限為5 μg/mL；按信噪比S/N≥10，得出定量限為13 μg/mL。

2.4 精密度

2.4.1 重復性 供試品工作液(500 μg/mL)按照1.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算主峰峰面積相對標準偏差(RSD)。結果表示，RSD為0.11%，重復性良好。

2.4.2 方法精密度 配制6份供試品工作液(500 μg/mL)按照1.2項下色譜條件進樣，計算主峰峰面積RSD。結果表明，RSD為0.23%，方法精密度良好。

2.4.3 中間精密度 同一人員，不同時間另配制6份供試品工作液(500 μg/mL)，按照1.2項下色譜條件進樣，計算主峰峰面積RSD，以及與方法精密度平均結果的相對偏差(RD)。結果表明，中間精密度主峰峰面積RSD為0.14%，與方法精密度平均結果的相對偏差為0.17%，小于2.0 %，該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 準確度 空白輔料中分別加入乳酸對照品318.35、265.45、212.56 mg各三份，制成高、中、低三個濃度(120%、100%、80%)的樣品。分別取充分混勻后的上述樣品適量，按1.3項條件下配制為供試品工作液，按照1.2項下色譜條件進樣檢測，另取乳酸對照品工作液(500 μg/mL)進樣檢測。記錄峰面積并計算回收率及RSD。結果如表1所示，平均回收率為98.50%，RSD為0.32%，準確度良好。

表1 乳酸準確度(回收率)試驗結果

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗 供試品工作液(500 μg/mL)室溫條件下放置24 h，分別于0、2、4、6、8、10、24 h按照1.2項下色譜條件進行測定，計算放置不同時間下乳酸的含量并與0 h初始值峰面積比較。結果表明，放置24 h后峰面積為初始值的100.02%，乳酸含量RSD為0.09%，表明該溶液在24 h以內具有很好的穩(wěn)定性。

2.7 耐用性

2.7.1 檢測波長考察 取供試品工作液及對照品工作液(500 μg/mL)適量，考察在210～220 nm范圍內不同檢測波長對乳酸含量測定的影響。結果表明，主成分乳酸含量RSD為0.11%，表明在檢測波長在210～220 nm之間樣品中主成分乳酸的含量能準確測定。

2.7.2 檢測流速的考察 取供試品工作液及對照品工作液(500 μg/mL)適量，考察0.8～1.2 mL/min范圍內不同檢測流速對乳酸含量測定的影響。結果表示，主成分乳酸含量RSD為0.07%，表明在檢測流速在0.8～1.2 mL/min之間樣品中主成分乳酸的含量能準確測定。

2.7.3 檢測柱溫的考察 取供試品工作液及對照品工作液(500 μg/mL)適量，考察30～40 ℃范圍內不同檢測柱溫對乳酸含量測定的影響。結果表示，主成分乳酸含量RSD為0.40%，表明在檢測柱溫30～40 ℃之間樣品中主成分乳酸的含量能準確測定。

2.7.4 不同流動相組成比例的考察 取供試品工作液及對照品工作液(500 μg/mL)適量，考察不同流動相組成比例(表2)對乳酸含量測定的影響。結果表示，主成分乳酸含量RSD為0.34%，表明在此5組不同流動相比例樣品中主成分乳酸的含量能準確測定。

表2 五組不同流動相比例

2.7.5 不同色譜柱的考察 取供試品工作液及對照品工作液(500 μg/mL)適量，考察相同類型不同品牌的色譜柱(表3)對乳酸含量測定的影響。結果顯示，主成分乳酸含量RSD為0.51%，表明使用相同類型不同品牌的色譜柱樣品中主成分乳酸的含量能準確測定。

表3 三根不同色譜柱

2.8 樣品含量測定 取二氧化氯乳頭消毒劑五批(YL200507、YL200512、YL200515、YL211020、YL211021)，按1.3項條件下配制為供試品工作液，按照1.2項條件下色譜進行檢測，五批樣品的含量分別為102.38%、103.95%、104.43%、100.94%、100.09%。

3 討論與結論

3.1 樣品前處理的優(yōu)化 二氧化氯乳頭消毒劑為本實驗室自主研發(fā)，用于擠奶后消毒的消毒產品，分為A劑(主要成分為乳酸)和B劑(主要成分為亞氯酸鈉)兩部分，使用時兩部分混合，亞氯酸鈉和乳酸發(fā)生歧化反應產生的二氧化氯為消毒作用的主要成分。為達到持續(xù)消毒的效果，本產品中含有增稠劑、穩(wěn)定劑和著色劑等輔料，滴定法等方法既無法測定A劑中輔料是否對乳酸含量有影響也無法測定混合后產品中乳酸的余量。

對二氧化氯乳頭消毒劑樣品進行前處理，主要目的是排除增稠劑、穩(wěn)定劑和著色劑等輔料對檢測結果的影響。樣品用超純水稀釋提取后，工作液渾濁，不易過0.22 μm的濾膜，需多次過濾，上機檢測時，主峰與雜質峰分離度較差，且雜質峰過多。樣品用乙腈和乙醇提取時，主峰峰型分叉。樣品用甲醇提取時，提取液易過膜，主峰響應高且與雜質峰完全分離，故選用甲醇作為提取液。由于甲醇中有羥基，微量乳酸與之反應，乳酸在水溶液中穩(wěn)定性好，樣品用甲醇提取后加水稀釋為供試品工作液，此溶液在24 h內穩(wěn)定。

3.2 色譜條件的選擇 根據(jù)相關文獻報道[15]及全波長(210～400 nm)掃描結果，乳酸的響應隨著波長增大而減弱，在215 nm處有良好的吸收且峰型及分離度較好，故選用215 nm作為檢測波長。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻[17-20]，流動相中水相相比有機相所占比例較大，大部分流動相都是含鹽流動相，此類流動相易堵塞儀器，需要耗費時間維護儀器，故選用不含緩沖鹽的流動相。流動相分別考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水等，結果以乙腈-0.1%磷酸水為流動相時，乳酸峰型及分離度最好。分別對表3中的三根色譜柱進行考察，含量測定選用乳酸峰型及分離度最好的色譜柱，即Capcell Pak C18MG色譜柱。

本文建立了HPLC法測定二氧化氯乳頭消毒劑中乳酸的含量方法，該方法線性關系良好，精密度高，準確度良好，溶液穩(wěn)定性和耐用性好，且操作簡便、可靠性好，可以用作該乳頭消毒劑中乳酸的質量控制。