非洲豬瘟病毒入侵細胞機制的研究進展

彭國瑞，鄒興啟，徐 嫄，徐小艾，朱元源，趙啟祖，劉業兵

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193；3.中國科學院微生物研究所，北京 100101)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起豬的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。ASFV可以感染家豬、野豬和鈍緣蜱等。自2018年8月遼寧省報告我國首例非洲豬瘟疫情[1]以來，非洲豬瘟已給養豬業造成巨大經濟損失[2]。到目前為止，針對ASFV還沒有有效的疫苗和抗病毒策略。ASFV是一種有囊膜雙鏈DNA病毒，粒子直徑約250 nm，呈正二十面體對稱結構，中央是包含基因組的核心結構，被一層含有多種蛋白成分的核殼包裹，緊接著向外延伸，分別是內脂膜，二十面體蛋白衣殼和最外層的外脂膜[3]。巨噬細胞是ASFV感染的主要靶細胞，體外經適應后可在PK15、Vero細胞和其他細胞上生長[4]，病毒通過吸附、穿入和脫殼在細胞內完成復制、組裝及子代病毒顆粒的釋放。本文就ASFV入侵細胞的有關研究進展進行了綜述。

1 病毒的吸附

1.1 受體介導的吸附 一般認為病毒顆粒感染細胞的首要條件是吸附細胞表面的受體。Alcamí A等[5]通過定量電子顯微鏡形態學分析發現，ASFV在感染的早期通過受體介導的內吞機制進入Vero細胞。之后，又用3H標記的ASFV與細胞結合，發現在質膜上存在飽和結合位點，從而使ASFV能夠在Vero細胞中啟動生產性感染。利用相同的方法，對于天然宿主巨噬細胞，病毒與細胞特定的飽和部位結合，通過受體介導的內吞機制進入細胞[6]。在平衡狀態下，結合數據Scatchard分析表明，每個細胞大約有104個細胞受體位點，解離常數(Kd)為70 pM[7]。通過ASFV與非易感動物的巨噬細胞相互作用試驗發現，ASFV顆粒可以利用非飽和結合位點介導進入兔巨噬細胞，并能夠合成一些早期病毒蛋白，但病毒DNA合成沒有發生，病毒復制被終止，提示這些細胞中不產生生產性感染，可能與缺乏特異性受體有關，并在其他不易感動物的巨噬細胞中也發現了類似的流產感染[8]。

1.2 病毒上的粘附蛋白 用非離子洗滌劑處理ASFV顆粒，釋放出蛋白p12(p17經巰基乙醇處理后)能夠與Vero細胞結合，不能與非洲豬瘟不易感的細胞結合，并且這種結合能夠被病毒顆粒特異性的阻斷，由此認為p12作為粘附蛋白參與細胞受體的識別[9]。然而，盡管通過自然感染和接種滅活病毒或重組蛋白p12的動物，可以誘導出針對p12蛋白的特異性抗體，但這些抗血清不能抑制病毒與宿主細胞的結合或中和病毒的傳染性[10]。此外，位于病毒顆粒類脂外膜的結構蛋白p54、p30能夠與豬肺泡巨噬細胞結合，用康復期豬或用重組p54或p30免疫豬獲得的抗體，能夠特異性的抑制這些蛋白與細胞的結合，同時，在易感細胞上p54和p30有著不同的飽和結合位點，且以劑量依賴的方式獨立地阻止病毒感染。用重組p54或p30蛋白的抗體，可以抑制病毒對易感細胞的附著或內化。然而，對免疫后的豬攻毒并沒有實現保護，病程也沒有改變。與此相反，用p54和p30蛋白組合免疫豬可以刺激產生對病毒的中和效應，并極大地改變病程，從延遲發病到完全阻止病毒感染產生了不同程度的免疫保護。p54阻斷了病毒顆粒與巨噬細胞的特異性結合，而蛋白p30阻斷了病毒的內化，二者都有助于抗體介導的保護性免疫反應[11]。

1.3 細胞上的膜蛋白受體 目前，對于ASFV的細胞受體仍不明確。鑒于p12與病毒吸附Vero細胞相關，用不同的酶和凝集素處理細胞表面，其中有幾種蛋白酶能夠抑制p12與細胞的結合，但沒有糖苷酶或脂肪酶，因此推斷該細胞受體由蛋白質組成，而沒有碳水化合物或脂類參與病毒的吸附；受體活性的恢復需要合成新的蛋白，而不是糖基化，因此，ASFV的受體是一種細胞表面的膜蛋白[12]。有學者就推測巨噬細胞標記物CD163可能是受體，用抗CD163的抗體作用巨噬細胞可以抑制ASFV，但對巨噬細胞上完全敲除CD163的豬，攻擊ASFV基因2型的Georgia 2007/1株后，敲除型豬和野生型豬都被感染，臨床癥狀、死亡率、病理或病毒血癥等都沒有差異；體外感染巨噬細胞試驗也沒有差異[13]，這項研究排除了CD163在ASFV感染中的重要作用。

2 病毒的穿入

病毒的吸附穿入是一個能量依賴的過程，可以通過多種方式進行；即便是同一種病毒也可以采用不同的內吞方式，這取決于細胞的類型、病毒的多樣性和生長條件。目前，對于ASFV進入細胞的方式仍存在很多爭議，包括依賴液泡pH和溫度的受體介導內吞[5]，或是通過網格蛋白(clathrin)介導內吞，還有人認為除了受體介導內吞外，病毒還可以同時以吞噬作用(phagocytosis)[3,14]或是大型胞飲(macropinocytosis)[4,15]進入細胞。

2.1 網格蛋白(clathrin)介導的內吞 Valdeira M L 等[16]利用電鏡研究ASFV與Vero早期相互作用時，發現病毒粒子附著在細胞表面后，被內陷的凹窩包裹，由內吞小體進入細胞，最后出現在溶酶體中，并沒有出現在包被囊泡(Coated vesicles)中，也沒有見到病毒直接穿過質膜的現象。與牛痘病毒(VV)不同，ASFV通過發動蛋白依賴和網格蛋白介導的內吞作用進入豬巨噬細胞，強烈依賴pH，Bernardes C等[17]發現清除膽固醇或用膽固醇氧化酶處理的Vero細胞在結合或內化病毒的能力上都沒有改變，但ASFV的融合和隨后的病毒復制卻被阻斷，因此，細胞膜中的膽固醇，而非脂筏或凹陷，是實現ASFV感染的必要條件。但是，Bruno Hernaez等[18]認為網格蛋白覆蓋的凹窩成分Eps15為感染相關細胞因子，以及發動蛋白GTPase活性、肌動蛋白依賴的內吞作用和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)活性等都參與了病毒的侵入[19]。

2.2 大型胞飲 Elena G Sa'chez等[15]將光學顯微鏡和電子顯微鏡結合，發現適應于Vero細胞生長的ASFV強毒株Ba71和強毒株E70可以引起細胞質膜擾動，起泡和褶皺。病毒粒子內化依賴于肌動蛋白重新組合、Na+/H+交換器的活性等典型的大胞飲內吞機制的信號，而且病毒進入細胞似乎直接刺激右旋糖酐攝取、肌動蛋白極化和EGFR、PI3K-Akt、Pak1和Rac1的激活，而抑制這些重要的大胞飲調節因子，以及使用藥物乙基異丙基氨氯吡咪(EIPA)治療，可以顯著減少ASFV的進入和感染[4]。但是，針對這觀點Bruno Hernaez 等發現Na+/H+離子通道抑制劑和肌動蛋白聚合抑制沒有顯著改變ASFV感染，認為大胞飲并不是ASFV的主要進入途徑[18]。

2.3 巨噬細胞內吞 Sameh Basta等[14]發現在病毒與細胞作用的過程中，二價陽離子依賴活性特別重要，這與內吞和內涵體處理所需的微管組裝的病毒需求有關。肌動蛋白依賴的內吞作用和涉及微管活性的內吞流通也密切相關，因此，認為受體介導內吞作用不是病毒進入感染宿主細胞M?的唯一方法，更像病毒是通過吞噬進入細胞的。Germán Andrés等[3]則認為ASFV通過巨噬細胞吞噬和網格蛋白介導的內吞兩種途徑進入巨噬細胞。

3 在內吞小體脫殼

ASFV感染的早期階段，病毒內吞進入細胞后一小時內脫殼，首先涉及到外層衣殼層的脫落，隨后是病毒內膜與內吞小體的融合[15]，其中，內吞小體的酸化對病毒的成功感染十分必要，逐步在低pH驅動下內吞小體分解[20]，再將裸的基因組核心釋放到細胞質中。這一過程中由Rab蛋白和PIs協調的EE和LE隔間以及內吞小體成熟通路的完整性發揮了核心作用[21]。病毒蛋白pE248R是病毒顆粒的晚期結構成分，具有分子內二硫鍵，氨基酸序列包含一個推定的肉豆蔻酰化位點和靠近其羧基末端的疏水跨膜區域，pE248R在感染過程中被肉豆蔻酰化，并與被感染細胞的膜部分結合成為一個完整的膜蛋白。pE199L是一個富含半胱氨酸完整的跨膜多肽，也具有分子內二硫鍵。研究表明，pE199L和pE248R不是病毒組裝、釋放以及病毒與細胞結合和內吞所必需的，而是膜融合和病毒基因組進入細胞所必需的，缺少這兩個基因的突變毒株，早期和晚期基因表達將受到損害，感染性大幅降低[22]。可以推斷，ASFV基因組進入細胞依賴于由pE248R和pE199L組成的融合機制，病毒在細胞內脫殼過程，這兩個蛋白發揮了與內吞小體的融合作用[23]。

4 病毒的生物合成

一旦ASFV脫殼脫離了內吞溶酶體復合體后，病毒就繞過成熟的溶酶體，包括自噬體-溶酶體傳遞，避免了被降解。然而，病毒的復制顯然還要依賴于某些溶酶體功能，即對丙胺敏感的活性是病毒所必需的，而長春堿和亮肽酶素敏感的功能僅部分影響病毒的復制[14]。而且，病毒需要通過內溶酶體、微管細胞骨架運輸系統轉運到生物合成的場所，已知的病毒編碼酶的合成、蛋白質合成都發生在細胞質的不同位置，而病毒基因組復制在細胞核內開始，而大部分的復制和組裝主要發生在細胞核周離散區域，即病毒工廠。在相關生物合成因子的研究方面，通過綠色熒光蛋白融合和MYC標記蛋白的重疊試驗結果表明，ASFV p37和p14蛋白具有核質轉運活性[24]。p14蛋白的作用是輸入到細胞核，p37蛋白在感染的早期階段存在于細胞核的局部，后期只在細胞質中[25]，參與病毒DNA在細胞核內外的轉運[26]。待病毒基因組和蛋白質合成后組裝成子代病毒粒子，沿著微管被運送到質膜，在那里它們通過出芽或由肌動蛋白推動離開被感染的細胞，病毒的進入和退出，都依賴于細胞骨架的各種成分[6]。與此同時，ASFV通過細胞內的通路誘導了感染細胞的凋亡[27]。

5 展 望

病毒進入細胞的途徑和方式決定了病毒的趨向性和發病機制。ASFV作為一種重要的動物傳染病原體，對其入侵的阻斷是預防和治療非洲豬瘟的重要研究目標，對ASFV與宿主細胞相互作用的研究，可深入揭示病毒致病和機體免疫的機制，為開發針對該病毒的新預防策略提供研究思路。但是，目前對ASFV入侵機制的了解仍然非常有限，特別是關于細胞受體、病毒穿入細胞的方式仍處于爭議之中，普遍認為ASFV通過多種方式穿入細胞。同時，病毒與天然宿主巨噬細胞和適應性Vero細胞的相互作用可能存在一定的區別。因此，進一步揭示ASFV的宿主細胞受體、穿入細胞的方式以及脫殼機制的研究仍然是未來的研究方向，也具有十分重要的現實意義。