液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中四環素類藥物殘留量的不確定度評定

武 煊，李小橋，鄒 銳*

(1.農業農村部畜禽產品質量安全監督檢驗測試中心(重慶)，重慶 401120；2.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 401120)

測定不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性，是測量結果質量的指標。不確定度越小，所得到的測量結果與被測量的真值越接近。實驗室在出具檢測報告和認可考核中都會涉及檢測結果不確定度的評定，ISO17025-2017《校準和檢測實驗室能力的通用性要求》明確要求“當不確定度與檢測結果有效性或應用有關，或客戶的指令中有要求，或不確定度影響到限度的符合性時，檢測報告中需包括有關不確定度的信息”[1]。

四環素類藥物主要包括土霉素、四環素、金霉素和強力霉素等[2]，是目前全球范圍內使用廣泛的一類抗生素[3-5]。現在主要采用高效液相色譜法[6-7]和液相色譜-串聯質譜法[8-9]對其殘留量進行檢測，對其不確定度的研究也多見報道[10-15]，但目前尚未見采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)對豬肉中四環素類藥物進行不確定度評定的報道。

采用GB/T 21317-2007的檢測方法，依據CNAS-GL 006-2019《化學分析中不確定度的評估指南》[16]和JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[17]要求，采用LC-MS/MS對豬肉中土霉素、四環素、金霉素和強力霉素殘留量的不確定度進行分析與評定，旨在提高檢驗結果的可靠性，為實驗室的質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 液相色譜-串聯質譜儀 AB 5500Q(美國 ABI SCIEX公司)；電子分析天平 XP205(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

對照品購買自德國Dr.Ehenrnstorfer公司，鹽酸土霉素，含量：96.02%，不確定度：0.19%；鹽酸四環素，含量：97.15%，不確定度：0.18%；鹽酸金霉素，含量：92.5%，不確定度：5.0%；鹽酸強力霉素，含量：99.3%，不確定度：2.0%。

Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國Waters公司)，甲醇、乙腈(色譜純，德國 Merck公司)；其它試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取豬肉試樣5 g(精確至 0.01 g)于 50 mL離心管中，加入0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液20 mL，振蕩10 min，10000 rpm離心，取上清液，重復提取一次。合并兩次提取液，用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine定容于50.00 mL容量瓶中。過濾，吸取10.0 mL提取液轉移至 HLB固相萃取柱中(使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水進行活化)，提取液流干后分別用 5 mL水和 5 mL 5%甲醇水進行淋洗，抽干后用 10 mL甲醇-乙酸乙酯(1+9)(V/V)洗脫，洗脫液用氮吹至干，用1.0 mL 10%甲醇溶液溶解殘渣，用0.22 μm有機相濾膜過濾，供LC-MS/MS測定。

1.2.2 標準溶液的配制 準確稱取鹽酸土霉素 27.65 mg，鹽酸四環素27.93 mg，鹽酸金霉素28.62 mg，鹽酸強力霉素26.19 mg于4個 25 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容，作為四環素標準貯備液。精確吸取各標準儲備液1.0 mL于同一100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，得到標準工作液。再用10%甲醇稀釋，得到各組分濃度分別約為10、20、50、100、200 ng/mL的對照溶液，供測試用。

1.2.3 儀器條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，1.7 μm)；流速為0.25 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量：5 μL；流動相梯度洗脫程序見表2。

表3 多反應監測條件

1.2.4 回收率的計算 采用加標回收的方式，稱取5份質量均為5.00 g的豬肉空白樣品，添加四環素類藥物工作液0.025 mL，制備成加標水平約為50 μg/kg的陽性添加樣品。按1.2.1的過程進行前處理后，按1.2.3的儀器條件進行檢測，計算回收率。

2 數學模型的建立

豬肉中四環素類藥物殘留量計算公式：

式中：X：供試品中待測組分的含量，μg/kg；

m：供試品稱樣量，g；

A：供試品相應目標化合物的峰面積；

As：標準溶液中相應目標化合物的峰面積；

Cs：標準溶液中相應目標化合物的濃度，ng/mL；

V1：提取液總體積，mL；

V2：過HLB固相萃取柱的提取液體積，mL；

V3：最終定容體積，mL。

3 不確定度來源分析

根據檢測方法以及數學模型，豬肉中四環素類獸藥殘留量不確定度分量主要來源有：

Urel(1)：樣品稱量引入的不確定度；

Urel(2)：樣品定容引入的不確定度；

Urel(3)：標準物質引入的不確定度；

Urel(4)：回收率引入的不確定度；

Urel(5)：測試過程中隨機效應引入的不確定度。

4 不確定度分量的評定

4.2 樣品定容引入的不確定度

4.2.1 容量瓶和移液管刻度引入的不確定度 依據JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[18]，A級50 mL容量瓶、10 mL移液管、1 mL刻度移液管的最大允許誤差分別為±0.05、±0.020、±0.008 mL，按矩形分布，k=3，則50 mL容量瓶、10 mL移液管、1 mL刻度移液管分別引入的標準不確定度為：

容量瓶和移液管引入的相對標準不確定度為：

U(2.4)=

4.2.2 溫度引入的不確定度 玻璃儀器的校準溫度為20 ℃，實驗室的實際溫度范圍為20 ℃±3 ℃，水在此溫度下的膨脹系數為1.80×10-3，假設溫度變化按矩形分布，k=3，50 mL容量瓶、10 mL移液管和1 mL刻度移液管的標準不確定度分別為：

溫度變化引入的相對標準不確定度為：

U(2.8)=

樣品定容引入的相對標準不確定度為：

4.3 標準物質引入的不確定度

表4 標準物質純度的相對標準不確定度

則移液管的相對合成標準不確定度為：

4.3.5 標準工作曲線配制引入的不確定度 分別移取 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL標準中間液到100 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液定容，得到標準工作液曲線。標準工作液曲線的相對合成標準不確定度見表5。

表5 配制標準工作曲線溶液引入的不確定度

4.3.6 標準曲線擬合引入的不確定度 對標準工作溶液的5個點分別測定1次，得到相應的色譜峰面積，采用最小二乘法進行擬合，得到土霉素、四環素、金霉素、強力環素的回歸曲線方程。得到各組分的線性回歸方程及回歸系數分別為：土霉素：y=0.8434x+3.4863，R2=0.9996；四環素：y=1.0153x+0.2832，R2=0.9993；金霉素：y=1.0142x+0.5395，R2=0.9991；強力霉素：y=1.013x-0.1466，R2=0.9997。計算標準曲線的殘差標準差(見表6)：

其中：n：標準曲線濃度點數，n=5；

yi：濃度為xi所對應的實測峰面積；

計算標準工作曲線擬合引入的不確定度(表6)：

表6 標準曲線的不確定度

其中：s：標準曲線的殘差標準差；

b：標準曲線的截距；

n：參與校準曲線擬合的濃度點的個數，n=5；

p：陽性添加樣品測定次數，p=5；

xi：校準曲線各點的濃度, ng/mL；

對上述標準物質的各分量不確定度進行合成，得到相對合成標準不確定度(表7)。

表7 標準物質的相對合成標準不確定度

4.4 回收率引入的不確定度評價 樣品前處理方法較為復雜，包括提取、凈化、洗脫、濃縮等過程，本實驗的回收率采用1.2.4的方法制備5份陽性添加平行樣品，測得各組分的回收率?？紤]平均回收率引入的不確定度(表8)。

表8 回收率引入的不確定度

Sr：回收率標準偏差

對回收率采用t檢驗進行顯著性分析，以確定檢測結果是否需要進行回收率校正(表8)。當自由度f=4時，查t臨界分布表，t(0.05，4)=2.776。據表8可知，各組份t檢驗結果分別為：土霉素t=0.007<2.776，四環素t=0.050<2.776，金霉素t=0.134<2.776，強力霉素t=0.081<2.776，故回收率無顯著性差異，不必用回收率校正結果。

4.5 隨機效應引入的不確定度 對加標樣品重復性測定5次，計算隨機效應引入的相對不確定度(表8)。

S：陽性添加樣品添加量測定值標準偏差

5 合成標準不確定度評定

由上述各相對不確定度合成豬肉中四環素類獸藥殘留量的相對標準不確定度；取包含因子K=2，計算擴展不確定度(置信概率為95%時包含因子)(表9)：

表9 相對標準不確定度

U=K×Urel

液相色譜-串聯質譜儀測定豬肉中四環素類獸藥殘留結果表示為：土霉素(50.05±5.44)μg/kg、四環素(42.81±6.72)μg/kg、金霉素(42.45±2.86)μg/kg、強力霉素(41.60±4.80)μg/kg。

6 結 論

液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中4種四環素類獸藥殘留的不確定度主要來源按影響大小主要來源于回收率、標準物質和隨機效應。因此，在實際檢測工作中可以通過制定實驗室SOP來規范不同檢測人員的操作過程，選擇精度更高的玻璃儀器進行標準溶液的配制，減少隨機誤差來提高檢測結果的準確性。