復方楊樹花口服液體內抗炎效果的研究

郭金梅，魏淑英，李得鑫，高錄軍

(1.濰坊市農業農村局，山東濰坊 261000；2.山東畜牧獸醫職業學院，山東濰坊 261061；3.山東華農生物制藥有限公司，山東濰坊 262000)

炎癥是機體對感染、組織損傷及傷害性刺激等做出的保護性反應[1]。表現為紅、腫、熱、痛及功能障礙，在一定范圍內可提高機體抵抗力，但持續炎癥反應會對機體造成損傷，攻擊自身組織，影響動物機體的健康[2]，炎癥反應也是一些疾病的發病基礎[3]。復方楊樹花口服液在楊樹花口服液的基礎上進行復方改良，以期解決動物體腸道炎癥問題。因此，試驗通過預先使用復方楊樹花口服液，對小鼠耳腫脹、足趾腫脹和血清中TNF-α，IL-1，IL-6分泌量的影響，以探究復方楊樹花口服液的體內抗炎效果。為進一步開發復方楊樹花口服液的藥理作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗藥品 復方楊樹花口服濃度1 g/ml(生產批號：20200402)，由濰坊富言中藥研發有限公司提供；阿司匹林片(生產批號：A100601)，購自山西云鵬制藥有限公司。

1.2 試驗動物 昆明小鼠120只，雄性，體重(30±2 g)，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司(動物許可證號SCXK(京)2020-0002)。

1.3 主要試劑 二甲苯(生產批號：20190325)，購自南京試劑公司；LPS(生產批號：084M4159V)，購自Sigma公司型號L2880；TNF-α(生產批號：P131773)，IL-1(生產批號：338392)，IL-6(生產批號：333552)ELISA試劑盒，購自RD公司。

1.4 主要儀器 打孔器，購自河南智科弘潤環保科技有限公司；分析天平，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；高速離心機，購自上海安亭科學儀器廠，CKX41光學顯微鏡，購自Olympus公司，全波長酶標儀購，自Bio-Tek公司。

1.5 試驗設計及分組

1.5.1 小鼠耳廓腫脹試驗 取雄性小鼠40只，隨機分為5組，8只/組，分別是空白對照組(生理鹽水：6 mL/kg)，陽性對照組(阿斯匹林:200 mg/kg)和給藥組(高劑量組(12 mL/kg)、中劑量組(6 mL/kg)、低劑量組(3 mL/kg))，每天灌胃給藥1次，連續給藥7 d。末次給藥45 min后，左耳涂抹二甲苯20 μL/只，右耳對照，40 min后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用打孔器(8 mm/直徑)分別在左右耳同一部位打下圓耳片，稱重，每只鼠左右耳片重量之差值作為耳腫脹度，計算各組腫脹率。

1.5.2 小鼠足趾腫脹率試驗 取雄性小鼠40只，試驗分組與給藥同1.5.1。末次給藥45 min后，右后足足跖中部皮下注射0.1 mL 1%雞蛋清致炎。于致炎前和致炎后30 min，60 min，120 min按容積法測定每鼠右后肢正常足容積，計算足跖腫脹率及足腫脹抑制率。

1.5.3 體內炎癥因子的檢測 取雄性小鼠40只，隨機分為5組，8只/組，分別是空白對照組，陽性對照組(LPS:15 mg/kg)和給藥組高劑量組(12 mL/kg)、中劑量組(6 mL/kg)、低劑量組(3 mL/kg)，每天灌胃給藥1次，連續給藥7 d。末次給藥6 h后，除空白對照組外，各組均以15 mg/kg劑量的LPS進行腹腔注射，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。各組于腹腔注射LPS 12 h后，摘眼球采血，分離血清。ELISA測定小鼠血清中TNF-α，IL-1，IL-6 含量。

2 結果與分析

2.1 對小鼠耳廓腫脹度的影響 由表1可知，與空白組相比，阿司匹林組與高、中、低劑量復方楊樹花口服液組均能顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹(P<0.01)，且高劑量復方楊樹花口服液與阿司匹林效果相似(P>0.05)。

表1 復方楊樹花口服液對小鼠耳腫脹度的影響

2.2 對足趾腫脹度的影響 由表2可知，與空白對照組相比，復方楊樹花口服液三個劑量組在30 min、60 min、120 min均能顯著抑制1%蛋清引起的小鼠足趾腫脹(P<0.01或P<0.05)。并且在60 min～120 min小鼠足趾腫脹度達到峰值。高、中劑量復方楊樹花口服液能達到阿司匹林相似效果(P>0.05)，但高劑量效果更好。

表2 復方楊樹花口服液對小鼠足趾不同時間段腫脹度的影響

2.3 對小鼠血清炎癥因子的影響 由表3可知，與空白對照組相比，LPS能極顯著性提高小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6的分泌量(P<0.01)，提前使用高劑量的復方楊樹花口服液能極顯著性抑制TNF-α，IL-1β，IL-6的異常分泌，與空白對照組差異不顯著(P>0.05)，提前使用低劑量的復方楊樹花口服液能顯著抑制TNF-α，IL-1β，IL-6的異常分泌(P<0.01)，但與空白對照組相比差異仍然顯著(P<0.01)。

表3 復方楊樹花口服液對小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6分泌量的影響

3 討論與結論

復方楊樹花口服液由蒼術、陳皮、厚樸、黃連、黃柏、柴胡、梔子、楊樹花組成，主要功效燥濕解毒、芳香醒脾。試驗采用二甲苯耳廓涂抹、蛋清足部注射、LPS腹腔注射的方法建立小鼠炎癥模型，以阿司匹林作為西藥對照，觀察復方楊樹花口服液的抗炎作用。用二甲苯進行耳腫脹實驗，可增加毛細血管的通透性，使滲入組織的液體增多，小鼠耳朵會出現紅腫[4]。耳廓腫脹度試驗結果表明，阿司匹林能有效預防二甲苯引起的耳廓炎癥反應，與王飛等研究相同[5]。12 mL/kg的復方楊樹花口服液也可預防炎癥反應的發生，但隨著藥物濃度的降低效果變差。異體蛋白致腫法是制備急性炎癥模型的常用方法[6]，異體蛋白進入機體后可在短時間內引起組織的急性炎癥反應，發生炎癥的部位明顯腫脹、體積增大，產生紅、腫、熱、痛等致炎癥狀[7]。足趾腫脹度試驗結果表明，注射0.1 mL 1%蛋清后，在60 min～120 min內小鼠足趾腫脹度達到峰值，30 min時，阿司匹林與各劑量復方楊樹花口服液均能起到良好抗炎作用，但60 min～120 min時，阿司匹林與低劑量復方楊樹花口服液效果下降，說明阿司匹林在60 min后體內藥物濃度降低，復方楊樹花口服液抗足趾腫脹度需灌胃6 mL/kg以上。

小鼠腹腔注射LPS建立的小鼠炎癥模型具有方便、穩定的特點而被廣泛應用，LPS能引起小鼠巨噬細胞分泌大量的炎癥因子到血清中[8]。TNF-α是一種腫瘤壞死因子，能誘導多種炎癥因子產生，使細胞凋亡，其表達量的多少可以直接反映炎癥的嚴重程度[9]。IL-6和IL-1β也是炎癥反應的重要指標，過多的表達會引起一系列的炎性損傷[10]。有研究發現對脂多糖誘導的急性炎癥小鼠模型都有明顯的保護效應的藥物，多數能明顯抑制小鼠血清和肝臟中炎癥因子釋放，使急性炎癥得到有效逆轉[11]。因此，抑制血清炎癥因子釋放和臟器巨噬細胞活化是發揮抗炎作用的重要指標[12]。血清炎癥因子試驗發現復方楊樹花口服液能顯著性降低LPS誘導的炎癥小鼠血清內TNF-α，IL-1，IL-6 含量(P<0.01 orP<0.05)，可見，復方楊樹花口服液對LPS誘導的小鼠炎癥模型有保護效應，但濃度越低，效果越差。

綜上所述，試驗初步證實復方楊樹花具有抗炎的效果，但其分子機制尚不清楚，需要進一步探究。