3 種中草藥對懸游雙眉蟲抗氧化酶活性的影響

呂湘琳，齊紅莉，王 茜

(天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384)

在我國水產養殖業中存在很多危害性問題，在眾多問題中纖毛蟲原生動物引起的危害成為了影響水產養殖的首要因素[1]。目前我國防治此類纖毛蟲病害主要采用化學藥物以及抗生素類藥物等對危害性纖毛蟲進行殺滅[2-3]，其大量使用會帶來藥物殘留風險、環境污染等問題，甚至對人類的健康造成威脅[4-5]，因此某些化學藥物已被禁用。尋找化學藥物及抗生素藥物以外的其他安全高效替代控制方法已經成為水產養殖健康發展的關鍵。大量研究表明，中草藥在水產養殖中不僅可以有效地抑制各種病原微生物[6-7]，還可以提高魚體免疫力[8-10]，并且具有高效、天然、環保、價廉、低殘留、易于制備等優點[11-12]。因此，使用中草藥殺滅病害性纖毛蟲符合水產養殖健康、無公害的要求。

懸游雙眉蟲Diophrys appendiculata隸屬于多膜綱，游仆目，游仆蟲科，雙眉屬[13]，是廣泛存在于養殖水體中的優勢種[14]。目前對于雙眉蟲病害多使用高錳酸鉀，福爾馬林及魯哥氏液進行殺滅[15]。而關于中草藥對懸游雙眉蟲的殺滅效果未見報道。當生物體在受到外界干擾時，生物體內產生活性氧(ROS)，活性氧的積累會導致氧化應激反應，進一步對生物體造成損傷[16]。因此，機體會啟動抗氧化酶防御系統來抵御毒性損傷。其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是生物體內重要的抗氧化酶，可起到自由基清除劑的作用。由于抗氧化酶活性的變化是由于活性氧的產生而誘導的，其可作為氧化應激毒性的生物標志物。

本試驗以養殖中常見的危害種懸游雙眉蟲為試驗動物，研究了檳榔、土槿皮、仙鶴草3 種中草藥對懸游雙眉蟲抗氧化酶活性的影響，分析了SOD、CAT、GPx 的劑量-效應關系和時間-效應關系，利用整合生物標志物響應指數(IBR)評價3 種中草藥對懸游雙眉蟲的毒性效應，旨在為水產養殖中危害性纖毛蟲的防治及控制提供基礎數據及應用推廣。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

試驗用懸游雙眉蟲由中國海洋大學原生動物學實驗室種庫惠贈。試驗前將懸游雙眉蟲置于鹽度30 滅菌的人工海水中培養，以商業干酵母為食，在28 ℃恒溫、光照強度為2 000 lx、光照周期14 L：10 D(即白晝14 h，黑夜10 h)條件下進行擴大培養。

1.1.2 試驗用藥

試驗所用中草藥均采購自天津市南開區華瑞大藥房。中草藥的制備根據聶江力等[17]的方法進行。總蛋白(A045-2-2)、超氧化物歧化酶SOD(A001-1-2)、過氧化氫酶CAT(A007-1-1)和谷胱甘肽過氧化氫酶GSH-Px(A005-1-2)的試劑盒均采購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶樣的制備

根據HONG Yazhen，et al[18]和LI Jiqiu，et al[19]的研究方法，將處于指數生長期的懸游雙眉蟲進行暴露試驗、樣品制備。將懸游雙眉蟲經毛細玻璃管吸取到含有設置好的藥物質量濃度的處理組中，中草藥的濃度根據鄭曉楠等[20]的研究設置，各中草藥原藥液經稀釋后得到的具體藥物質量濃度分別為：檳榔為0、5.44、10.87、21.74 mg·L-1；土槿皮為0、5.64、11.29、22.57 mg·L-1；仙鶴草為0、11.12、33.35、100.06 mg·L-1。暴露試驗在50 mL 的細胞培養瓶中進行，每個細胞培養瓶中的終體積是40 mL，懸游雙眉蟲的密度為106ind.·L-1，每個處理組設3 個重復，試驗持續48 h 每12 h 測定1 次。

暴露于不同中草藥后，在每個間隔時間點(12、24、36、48 h)從每個處理組中收集懸游雙眉蟲細胞，使用隔膜真空泵進行抽濾，收獲樣品。在粗酶提取的預處理過程中，樣品被保存在冰浴中。

1.2.2 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用細胞色素C 還原法[21]，SOD 酶活力單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL 反應液中SOD 抑制率達50%時對應的SOD 量為1 個酶活力單位。過氧化氫酶(CAT)活性測定采用鉬酸銨法[22]，CAT 酶活力單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O2的量為1 個酶活力單位。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性通過NADPH 氧化率測定[23]，GPx 酶活力單位定義：每毫克蛋白質，每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中GSH 濃度降低1 μmol·L-1為1 個酶活力單位。總蛋白質含量根據BRADFORD M M[24]的方法測定。具體操作方法參照南京建成試劑盒說明書進行。

1.3 數據分析

抗氧化酶活性數據采用平均值±標準差。數據用Sigmaplot 12.5 作圖，使用SPSS 24.0 進行重復測量方差分析(rANOVA)確定藥物劑量，處理時間以及劑量-時間相互作用的顯著性分析[25]；使用單因素方差分析(One-way ANOVA)確定抗氧化酶活性之間是否存在顯著差異(P＜0.05 表示差異顯著)。IBR 值的計算根據BROEG K，et al[26]的方法進行。

2 結果

2.1 檳榔、土槿皮和仙鶴草對懸游雙眉蟲SOD 酶活性的影響

rANOVA 結果表明，除檳榔作用下劑量與時間的相互作用外，其他中草藥的濃度以及處理時間對懸游雙眉蟲SOD 酶活性的影響差異顯著(P＜0.05，表1)；懸游雙眉蟲的SOD 活性劑量-效應反應，總體呈上升至峰值后下降的趨勢(倒U 型曲線，圖1 A，B，C)。檳榔作用下SOD 酶活性峰值大部分出現在較低濃度組(5.44 mg·L-1)，土槿皮作用下SOD 酶活性峰值在12～24 h 出現在較低濃度組(5.64 mg·L-1)，24～48 h 出現在較高濃度組(11.29 mg·L-1)，仙鶴草作用下SOD 酶活性峰值則出現在較高濃度組(33.35 mg·L-1)。箱型圖分析表明(圖2 A，B，C)，隨著中草藥暴露時間的延長，懸游雙眉蟲SOD 活性的變化均呈先升高后降低的趨勢，檳榔、土槿皮作用下的懸游雙眉蟲SOD 酶活性在24 h 達到峰值，仙鶴草作用下懸游雙眉蟲SOD 酶活性在36 h 達到峰值。

圖1 不同濃度中草藥作用下懸游雙眉蟲的抗氧化物歧化酶(SOD)活性Fig.1 SOD activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

圖2 不同中草藥暴露時間下懸游雙眉蟲的抗氧化物歧化酶(SOD)活性的箱形圖分析Fig.2 Box-chart analyses of SOD activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

表1 中草藥作用下懸游雙眉蟲抗氧化酶的rANOVA 反應結果Tab.1 Results of rANOVA for responses of D.appendiculate antioxidant enzymes following exposure to Chinese herbal medicines

2.2 檳榔、土槿皮和仙鶴草對懸游雙眉蟲CAT 酶活性的影響

rANOVA 結果表明，3 種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用對懸游雙眉蟲CAT 活性均有顯著影響(P＜0.05，表1)；隨著中草藥暴露劑量的增加，CAT 活性呈現了顯著的劑量-效應關系(圖3 A，B，C)，其中土槿皮作用下，24 h 組間CAT 活性持續下降，48 h 組間CAT 活性差異不顯著(P＞0.05)。仙鶴草作用下，CAT 活性達到峰值的暴露濃度隨暴露時間的增加而升高，在12 h 和48 h 時高濃度組(100.06 mg·L-1)的CAT 活性顯著低于對照組。箱型圖分析表明(圖4 A，B，C)，隨著檳榔暴露時間的延長，懸游雙眉蟲CAT活性呈先上升后下降的趨勢，在36 h 達到峰值(P＜0.05)；在土槿皮作用下，隨暴露時間的延長，懸游雙眉蟲CAT 活性下降，峰值出現在12 h(P＜0.05)；仙鶴草作用下，懸游雙眉蟲CAT 活性隨時間無明顯變化(P＞0.05)。

圖3 不同濃度中草藥作用下懸游雙眉蟲的過氧化氫酶(CAT)活性Fig.3 CAT activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

圖4 不同中草藥暴露時間下懸游雙眉蟲的過氧化氫酶(CAT)活性的箱形圖分析Fig.4 Box-chart analyses of CAT activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

2.3 檳榔、土槿皮和仙鶴草對懸游雙眉蟲GPx 酶活性的影響

rANOVA 結果表明，三種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用對懸游雙眉蟲GPx 活性均有顯著影響(P＜0.05，表1)。隨著中草藥暴露劑量的變化，懸游雙眉蟲GPx 活性總體上呈現先上升后下降的趨勢(圖5 A，B，C)。在檳榔、土槿皮高濃度組懸游雙眉蟲GPx 活性顯著低于對照組(P＜0.05)。箱型圖分析表明(圖6 A，B，C)隨中草藥作用時間變化，檳榔、土槿皮作用下懸游雙眉蟲的GPx 呈現倒U 型曲線，在12 h 達到峰值(P＜0.05)，仙鶴草作用下蟲體GPx 活性逐漸下降，在48 h 達到最低值(P＜0.05)。

圖5 不同濃度中草藥作用下懸游雙眉蟲的谷胱甘肽過氧化氫酶(GPx)活性Fig.5 GPx activities in D.appendiculate exposed to different concentrations of Chinese herbal medicines

圖6 不同中草藥暴露時間下懸游雙眉蟲的谷胱甘肽過氧化氫酶(GPx)活性的箱形圖分析Fig.6 Box-chart analyses of GPx activities in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

2.4 整合生物標志物分析

不同劑量檳榔、土槿皮、仙鶴草脅迫下懸游雙眉蟲的整合生物標志物水平變化如圖7 所示。從劑量效應分析，檳榔作用下懸游雙眉蟲IBR 值總體上呈現先上升后下降的趨勢，在5.44 mg·L-1濃度下達到峰值，土槿皮作用下懸游雙眉蟲IBR 響應也呈現了相似的趨勢，在11.29 mg·L-1濃度下達到峰值，仙鶴草作用下除對照組外，其他濃度組呈現上升趨勢，在100.06 mg·L-1濃度時達到峰值。從時間效應分析，檳榔作用下，對照組IBR 值無明顯趨勢，其他處理組IBR 值隨時間呈現先升后降的趨勢，均在24 h 達到峰值；土槿皮作用下，除5.64 mg·L-1組外，其他組IBR 值均在24 h 達到峰值，隨時間延長呈現下降趨勢；仙鶴草處理下，懸游雙眉蟲IBR 值隨時間變化趨勢不明顯。

圖7 不同中草藥暴露下懸游雙眉蟲整合生物標志物響應指標(IBR)的變化Fig.7 Variation of IBR in D.appendiculate exposed to different durations of Chinese herbal medicines

3 討論

近年來，越來越多的學者使用抗氧化酶作為毒性評估的生物標志物[27-28]，而中草藥對纖毛蟲抗氧化應激反應的影響鮮有學者研究。目前常被用作生物標志物的抗氧化酶有：超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)。SOD 可以催化過氧化物酶體和線粒體中產生的超氧陰離子，將其轉化為氧氣和過氧化氫[29]；CAT 是1 種具有強大催化功能的抗氧化酶，可以有效降解SOD 歧化生成的過氧化氫，分解過氧化氫并轉化為無毒的水和氧氣，從而進一步避免機體受到損傷[30]。GPx 是另一種重要的內源性抗氧化酶，用GSH 作為電子供體催化過氧化物，將其轉化為水和氧，并與SOD、CAT 一同避免機體受到氧化損傷[31-32]。

本研究中，懸游雙眉蟲的SOD 活性在3 種中草藥作用下總體上呈現先升高后下降的趨勢，這與HONG Yazhen，et al[33]研究的隨著呋喃西林濃度的增加，扇形游仆蟲Euplotes vannusSOD 的活性呈現先上升后下降的趨勢相似；李邦平[34]研究的棘尾蟲Stylonychiasp.受到輕度Zn2+脅迫時，SOD 的活性升高，而當Zn2+脅迫程度超出了棘尾蟲所能接受的范圍時，SOD 的活性則會受到抑制，產生細胞損傷，影響了棘尾蟲的分裂結果基本一致。上述現象說明，在低濃度中草藥作用于懸游雙眉蟲時，SOD 活性受到誘導升高，以快速清除活性氧來防止機體受到傷害，而高濃度下中草藥對懸游雙眉蟲產生了氧化壓力，對生物體產生了危害，從而影響了SOD 的合成。

本研究中，懸游雙眉蟲CAT 活性在3 種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用下均呈現極顯著差異(P＜0.01)，因此可作為生物標志物之一。在3 種中草藥作用下，懸游雙眉蟲CAT 活性的劑量-效應關系與SOD 基本相似。檳榔作用下，CAT 活性的時間-效應關系雖然也呈現先上升后下降的趨勢，但檳榔作用下的CAT 活性達到峰值的時間比檳榔作用下SOD 活性峰值的時間延后，這與韓現芹等[35]發現PCB153作用下半滑舌鰨Cynoglossus semilaevisCAT 活性誘導相較SOD 活性誘導呈現時間上的滯后性的研究相一致。造成此現象的原因是在中草藥脅迫下，蟲體SOD 酶將大量超氧陰離子轉化成H2O2，而大量H2O2在蟲體內積累，進而導致CAT 活性被大量誘導。在土槿皮、仙鶴草作用下，CAT 活性的時間-效應關系總體上呈下降趨勢。推測土槿皮、仙鶴草對懸游雙眉蟲產生了損傷。本研究還發現，高濃度組(22.57 mg·L-1)土槿皮作用下，蟲體CAT 活性無顯著差異，可能是高濃度的土槿皮破壞了蟲體的抗氧化酶系統所致，土槿皮的主要作用成分兒茶素可以增加細胞膜的通透性，造成胞內蛋白質和糖類物質的滲漏，使機體代謝發生紊亂[36]。

本研究中，懸游雙眉蟲GPx 活性在3 種中草藥濃度、暴露時間和時間劑量相互作用下均呈現極顯著差異(P＜0.01)，所以GPx 也可作為中草藥對懸游雙眉蟲的毒性的生物標志物之一。在3 種中草藥作用下，懸游雙眉蟲GPx 的活性隨濃度呈現先上升后下降的趨勢，也印證了SOD、CAT 活性變化的結果。RUAN Yuanyuan,et al[37]研究發現，暴露于苯酚下，扇形游仆蟲和多小核草履蟲Paramecium multimicronucleatumGPx 活性的劑量響應隨苯酚濃度的增加而呈倒U 型曲線，這與本研究結果基本一致。然而高濃度檳榔、土槿皮作用下48 h 懸游雙眉蟲的GPx 活性顯著低于對照組(P＜0.05)，是由于高濃度的檳榔、土槿皮對蟲體造成了損傷。多數學者研究發現，在水產養殖中對病害纖毛蟲有良好的殺滅作用的有效成分是檳榔的檳榔堿及檳榔次堿[38-40]。

由于不同抗氧化酶活性在中草藥作用下既出現誘導情況又存在抑制情況，且不同抗氧化酶對中草藥脅迫的響應不同，因此將這幾種抗氧化酶指標結合起來，即使用整合生物標志物響應指標(IBR)來進行分析可以更有效地評估藥物對纖毛蟲的毒性效應[41]。IBR 指數在環境污染檢測以及魚類毒性作用的評估中廣泛應用[42-43]。本試驗中，仙鶴草作用下懸游雙眉蟲的IBR 值最高，鄭曉楠等[20]研究證實中草藥對懸游雙眉蟲的毒性大小依次為：檳榔＞土槿皮＞仙鶴草，本研究在鄭曉楠等人研究的基礎上使用產生相同毒性效應的中草藥劑量進行試驗，發現毒性較低的仙鶴草對懸游雙眉蟲的抗氧化酶系統影響最顯著，孫希[44]也發現仙鶴草中鞣質成分可顯著提高小鼠血液中SOD 活力達到抗氧化作用。胡梁及等[45]的研究發現，當中草藥作用于患有車輪蟲病的金鼓魚Scatophagus argus時，仙鶴草對車輪蟲Trichodinasp.的毒性低于土槿皮和檳榔，這可能是不同的纖毛蟲對藥物的耐受性不同，但仙鶴草在800 mg·L-1對金鼓魚仍無毒性，因此仙鶴草可作為最安全的中草藥。

4 結論

綜上所述，3 種中草藥作用下，懸游雙眉蟲SOD、CAT、GPx 活性變化趨勢相似，CAT、GPx 活性的重復測量方差分析均呈現極顯著差異，因此CAT、GPx 活性的變化可作為纖毛蟲對中草藥響應的生物標志物；仙鶴草的IBR 指數總體上高于土槿皮和檳榔的IBR 指數，因此仙鶴草對懸游雙眉蟲的抗氧化酶活性影響最明顯。