17 種綿蟹線粒體COI 基因比較及系統進化分析

韋麗明，張 瑩，呂振明，龔 理，苗增良

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院，海洋生物種質發掘與利用國家地方聯合工程實驗室，浙江舟山 316022)

綿蟹，隸屬甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、短尾派Brachyura、綿蟹總科Dromioidea、綿蟹科Dromiidae[1]；生活于8～150 m 水深的泥底或泥沙底海區，我國廣東、海南、臺灣、福建等地均有分布。綿蟹科種類豐富，根據WoRMS 網站記載(http：//www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=106742&allchildren=1)，目前該科包括3 亞科49 屬共306 種。當前大多數研究聚焦于綿蟹的生態習性和形態結構等方面[2-4]，而較少關注該科種類在分子水平上的差異及種間親緣關系[3]。

基于形態學特征的傳統分類方法具有直觀、便捷等優點，但也容易受到環境因素和主觀因素的干擾，尤其是針對卵和仔稚生物樣品以及樣品破損等情況，僅依靠形態學特征有時也不能準確地進行物種鑒定[5-9]。隨著分子生物學的迅猛發展，DNA 條形碼(DNA barcoding)技術作為形態學輔助方法在分類學及群體遺傳學等領域應用越來越廣泛[6,10-11]。DNA 條形碼利用的是生物體內能夠代表該物種唯一的、相對較短且易擴增的一個或一些DNA 片段，能客觀準確區分不同物種[12]。目前應用最廣泛的DNA 條形碼是線粒體細胞色素C 氧化酶亞基I(Cytochrome c oxidase subunit I,COI)序列，截至2022 年4 月國際生命條形碼計劃(iBOL)數據庫中已有約1057 萬條DNA 條形碼。

自2003 年HEBERT,et al[13]首次提出DNA 條形碼概念以來，該技術從低等的真菌、藻類和無脊椎動物到高等的兩爬類、魚類和哺乳類都被證明在分類鑒定中是行之有效的[14-18]。例如：ORTMAN,et al[19]應用COI基因序列分析了1 種立方水母、10 種缽水母和84 種水螅水母的遺傳距離，證實了條形碼間隔的存在，并提出COI可作為水母亞門種類鑒定的分子標記；徐巖等[20]基于COI基因序列對中國沿海相手蟹Sesarmidae進行分子系統發育分析，結果表明相手蟹為多系起源，且日本的無齒螳臂相手蟹Chiromantes dehaani與長江口的無齒螳臂相手蟹C.neglectum雖然在形態上存在一定差異，但分子數據顯示兩者為同種異名；苗憲廣等[21]基于COI基因序列對28 種鰈形目Pleuronectiformes 舌鰨亞科Cynoglossinae 魚類進行系統發育研究，發現所有舌鰨亞科魚類形成一個單系群，并與無線鰨亞科Symphurinae 魚類形成穩定的姐妹群關系；此外，遺傳距離結果還支持紫斑舌鰨Cynoglossus purpureomaculatus和長吻紅舌鰨C.lighti分別與短吻三線舌鰨C.abbreviatus和短吻紅舌鰨C.joyneri互為同物異名關系。

本研究測定了德漢勞綿蟹Lauridromia dehaani和阿特拉斯平殼蟹Conchoecetes atlas的線粒體COI基因序列，結合GenBank 數據庫中已經公布的15 種綿蟹科COI基因部分序列，對這17 種綿蟹科種類的線粒體COI基因序列特征進行了比較分析，并基于這些COI序列構建了目前為止最全面的綿蟹科系統發育樹，以期探討COI序列在綿蟹物種鑒定中的適用性及綿蟹科物種之間的親緣關系，為保護綿蟹物種多樣性及短尾派系統發育的研究提供分子數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組提取

2019 年11 月于浙江舟山采集綿蟹樣品，將新鮮的綿蟹樣品用95%酒精保存，運輸至實驗室進行形態學鑒定，樣品鑒定參考《中國海洋蟹類》[1]和《中國動物志短尾次目海洋低等蟹類》等[22-23]。分別取綿蟹肌肉組織約30 mg 剪碎后置于離心管中，利用鹽析法提取綿蟹的基因組DNA，用紫外分光光度計檢測DNA 質量與濃度，并稀釋為50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2 引物設計與PCR 擴增

根據短尾次目線粒體COI基因的保守區域設計通用引物F1-COI：TCNACAAAYCATAAAGAYATYGG/R1-COI：TANACYTCWGGRTGHCCRAARAAYCA。PCR 擴增反應總體積為33 μL，包括正引物和反引物各1.5 μL，模板1.5 μL，Mix 酶15.0 μL，滅菌雙蒸水ddH2O 13.5 μL。擴增程序為先經過95 ℃預變性3 min 后，95 ℃變性30 s，48～54 ℃退火50 s，68 ℃延伸1 min，共進行35 個循環結束后再進行68 ℃繼續延伸10 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，將目的片段的PCR 純化產物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.3 序列注釋及分析

使用Sequin 軟件(version 15.10,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/)對本研究中測定的2 種綿蟹線粒體COI基因片段序列進行注釋；從GenBank 數據庫中下載目前所有15 種綿蟹科種類線粒體COI基因序列，利用軟件Clustal X 2.0[24]對這些序列進行比對，使用MEGA X[25]計算它們的堿基組成、保守位點和遺傳距離，利用軟件MatGAT 2.02[26]進行多序列相似性比較分析。

1.4 系統進化樹構建

為了探究本研究測定的2 種綿蟹及GenBank 數據庫中15 種綿蟹共17 種綿蟹物種之間的親緣關系，本研究以相手蟹科Sesarmidae 的無齒螳臂相手蟹C.dehaani和紅螯螳臂相手蟹C.haematocheir為外類群，基于上文分析的COI序列利用MEGA X[25]軟件同時構建綿蟹科最大似然樹(maximum likelihood,ML)和最大簡約樹(maximum parsimony,MP)，Bootstrap 設置為1 000 次，利用PhyloSuite 構建貝葉斯樹(Bayesian inference,BI)。

2 結果與分析

2.1 COI 基因序列比較分析

本研究測定的德漢勞綿蟹和阿特拉斯平殼蟹的線粒體COI基因序列提交至GenBank 數據庫中(登錄號分別為MZ928448 和MZ873493)。用于比較分析的17 種綿蟹COI序列對應的物種信息如表1 所示。比對序列的長度為495 bp，共連續編碼165 個氨基酸，不存在堿基插入或缺失現象。17 種綿蟹的堿基含量略有區別：34.3%～38.0% T、17.0%～22.0% C、26.9%～29.9% A 及15.2%～16.8% G，A+T 含量為61.2%～67.9%，平均含量為64.5%，G+C 含量為32.2%～38.8%，平均含量為35.5%(表1)，A+T 含量明顯高于G+C 含量，符合后生動物線粒體基因AT 偏倚性，與其他蟹類COI基因具有相同特點[20,27-28]。通過核苷酸序列比對顯示共有340 個保守位點，155 個變異位點(約占32.0%)，其中絕大多數為第三位密碼子(130 個變異位點)，而第二位密碼子十分保守僅有1 個變異位點，第一位密碼子有24 個變異位點(圖2a)。而將核苷酸翻譯成氨基酸序列后再比對，變異位點數僅3 個，其中2 個為自裔位點(singleton site)，變異位點率僅占1.82%(圖2b)，表明當第三位密碼子變異并不一定會使氨基酸發生改變。這是由于“遺傳密碼的簡并性”，即第三位密碼子具有搖擺性以確保遺傳性狀的穩定[29]。

圖2 17 種綿蟹線粒體COI 基因片段核苷酸(a)及氨基酸序列(b)比對Fig.2 Alignment of nucleotide (a) and amino acid sequence (b) of COI fragment of 17 Dromiidae species

表1 本研究構建系統發育樹所用物種信息Tab.1 List of 17 Dromiidae species and two outgroup used in this paper

2.2 遺傳距離及相似性分析

從GenBank 數據庫中下載了15 種綿蟹的COI序列，結合本研究測定的2 種綿蟹的COI序列，我們對這17 種綿蟹的COI序列相似性及遺傳距離進行了分析，結果顯示德漢勞綿蟹1 和德漢勞綿蟹4 之間的COI序列相似性最大(99.8%)，遺傳距離最小(0.002)；其次為綿蟹科未定種1 和綿蟹科未定種6，序列相似性和遺傳距離分別為99.4%和0.006，表明德漢勞綿蟹1 和4 以及綿蟹科未定種1 和6 分別為同一物種。而GenBank 數據庫中提交的德漢勞綿蟹(EU636986 和MG742718)與本研究中的德漢勞綿蟹4 的COI序列相似性分別為84.0%和96.4%，同時這兩者之間的序列相似性為85.3%，表明德漢勞綿蟹2 和3 可能鑒定有誤，不是真正的德漢勞綿蟹；遺傳距離也證實了這一觀點：德漢勞綿蟹2 和3 與本研究中的德漢勞綿蟹4 分別為0.180 和0.038，同時這兩者之間的遺傳距離為0.165，遠大于種內個體間之間的遺傳距離。綿蟹科未定種3 和4、海綿蟹Dromia erythropus和盲蟹D.personata以及德漢勞綿蟹3 和德漢勞綿蟹1 兩兩之間的序列相似性和遺傳距離分別為98.8%和0.012、98.2%和0.019、96.6%和0.036，暗示這些物種分別隸屬于同一個屬。

表2 17 種綿蟹科物種線粒體COI 基因片段遺傳距離(左下角)及序列相似性(右上角)Tab.2 The genetic distance (bottom left) and sequence similarity (upper right) based on COI fragment in 17 Dromiidae species

2.3 系統發育分析

以相手蟹科的無齒螳臂相手蟹C.dehaani和紅螯螳臂相手蟹C.haematocheir為外類群，同時構建了綿蟹科的最大似然樹(ML)、貝葉斯樹(BI)和最大簡約樹(MP)。最大似然樹與貝葉斯樹拓撲結構十分接近，除了綿蟹科未定種7位置略有區別外，其余親緣關系均一致；兩者明顯分為3 支：最先分出來的一支由Hypoconcha屬與安地列斯綿蟹M.antillensis組成；德漢勞綿蟹2 與綿蟹科未定種3、4、5、7 和阿特拉斯平殼蟹組成一支并與其余物種組成的一支形成姐妹群。最大簡約樹中德漢勞綿蟹2 與阿特拉斯平殼蟹形成一支；綿蟹科未定種7 獨立為一支；其余物種組成一支。不難發現3 種方法構建的系統發育樹拓撲結構存在一定差異，且大部分節點支持率均較低，表明本研究中基于部分線粒體COI序列不適用于綿蟹科屬間系統發育分析；但是在屬內水平，3 種建樹結果拓撲結構幾乎完全一致，且均具有非常高的支持率(＞96)，如：同為綿蟹屬Dromia的海綿蟹D.erythropus和盲蟹D.personata以及同為Hypoconcha屬的粗糙負殼蟹H.arcuata和H.parasitica分別聚在一起，表現出很近的親緣關系。結合COI序列相似性及遺傳距離結果，德漢勞綿蟹1、3、4 三者之間的系統關系顯示德漢勞綿蟹1 和4 為同一種類，而德漢勞綿蟹3 為鑒定錯誤，但能確定的是其仍為勞綿蟹屬種類；系統樹顯示德漢勞綿蟹2 與本研究中的阿特拉斯平殼蟹聚為一支，但是沒有跟勞綿蟹屬的3 個物種(德漢勞綿蟹1、3、4)聚在一起，結果表明德漢勞綿蟹2 鑒定有誤，但是仍不能確定其隸屬哪個屬；此外，系統樹明顯支持德漢勞綿蟹1 和4及綿蟹科未定種1 和6 分別為同一物種，與COI序列相似性及遺傳距離結果吻合。

圖3 基于線粒體COI 基因序列構建的綿蟹科最大似然樹(A)、貝葉斯樹(B)和最大簡約樹(C)Fig.3 Phylogenetic tree of Dromiidae species inferred from the COI sequence based on maximum likelihood (ML);Bayesian inference (BI) and maximum parsimony (MP) analysis

3 討論

線粒體COI基因是用于物種鑒定非常有效的分子標記之一，尤其是對形態特征極其相似的隱存種以及形態界限模糊不清或者形態破損不易區分的近緣種的鑒定提供有效的分子依據，很大程度上彌補了形態分類的不足[6,9,30]。通常依據是計算種內和種間的遺傳距離，通過比較兩者之間是否有顯著差異來判斷某個物種的分類地位[31-33]。HEBERT,et al[13]最早比較分析了11 個主要門13 320 種動物的COI序列后提出COI基因用于物種鑒定的標準是種內遺傳距離小于2%，且種間遺傳距離顯著大于種內遺傳距離(通常10倍以上)。該觀點在大量生物類群(如真菌、藻類、甲殼類、兩爬類、魚類和哺乳類等)均得到了驗證[13,34-36]。如王淑英等[36]在研究鰈形目鰨科(Soleidae)魚類物種鑒定時發現COI基因在種內和屬內種間的平均遺傳距離分別為0.33%和19.91%，兩者遺傳差異約為60 倍(個別最小相差19 倍)，符合HEBERT 提出的相差10 倍的物種鑒定標準；苗憲廣等[21]在比較分析28 種舌鰨亞科魚類COI基因序列時也發現舌鰨屬部分種類之間的遺傳距離已明顯超出種之間的分化。本研究中，15 種綿蟹的種內遺傳距離為0.2%～0.6%，平均遺傳距離為0.4%，遠小于HEBERT,et al[13]提出的2%標準；種間最小遺傳距離為1.2%(存在于2 種綿蟹科未定種3 和4 之間)，最大遺傳距離為21.6%，平均遺傳距離為15%，為種內平均遺傳距離的37.5 倍，大于HEBERT,et al[13]提出的10 倍標準，表明COI基因序列可以用于綿蟹科種類鑒定。

線粒體基因由于進化速率相對較快且不同基因進化速率不一致，使其成為系統進化研究十分理想的分子標記[37-39]。眾多線粒體基因中，COI基因被廣泛用于較低階元(如屬間、種間或群體水平等)系統進化分析，例如梁日深等[40]基于COI部分序列探討了石斑魚亞科Epinephelinae 中的10 屬共40 種魚類的系統親緣關系，結果支持鰓棘鱸屬Plectropomus為最原始的類群，石斑魚屬Epinephelus為最特化類群，駝背鱸屬Cromileptes、光腭鱸屬Anyperodon和寬額鱸屬Promicrops等與石斑魚屬有著非常近的親緣關系，暗示部分種類可能是石斑魚屬的特化類群；王秀亮等[41]分析了東海海域6 種常見梭子蟹之間的親緣關系，結果表明蟳屬與圓趾蟹屬親緣關系最近，兩者聚為一支再與梭子蟹屬聚在一起，為梭子蟹科的系統發育重建提供了重要的數據支持。本研究中不同方法構建的系統發育樹在屬間水平具有較明顯的差異，而在屬內水平，兩者拓撲結構幾乎完全一致，且支持率較高，表明本研究中COI基因因其有限的遺傳信息位點僅適用于屬內物種間系統關系分析，而對于較高階元的屬間親緣關系則解析度不夠。這也是為什么越來越多的研究趨向利用多個聯合基因甚至線粒體基因組全序列來進行群體遺傳及系統發育分析的原因[27-28,42]。針對具有較大分歧的屬間親緣關系，今后研究可以利用更多分子序列(多基因或者線粒體基因組全序列)以及更多代表種類來解決這些爭議。