聚丁內酰胺/殼聚糖電紡納米蛛網復合纖維膜的制備及性能

曾貝迪， 陳 濤,2,3， 趙黎明

（華東理工大學1.材料科學與工程學院, 上海市先進聚合物材料重點實驗室；2. 中國輕工業生物材料工程重點實驗室；3. 恒天生物基材料聯合研究院；4. 生物工程學院, 生物反應器工程國家重點實驗室,發酵工業分離提取技術研發中心, 上海 200237）

靜電紡絲技術是連續制備超細纖維的主要方法，但制備的纖維直徑一般在100 nm 以上。通 常，只有當纖維直徑小于50 nm 時才會顯現納米效應。納米蛛網纖維是靜電紡絲中形成的一種以常規電紡纖維為支架，并具有類似蜘蛛網或肥皂泡的多邊形網孔結構的二維網狀纖維，網狀纖維平均直徑僅為5～50 nm，具有極高孔隙率、多尺度孔徑分布、顯著納米效應等諸多特點[1]。目前已通過聚酰胺6、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚丙烯腈、聚氨酯等合成聚合物，以及殼聚糖（CS）、卵磷脂等天然大分子制備了一系列納米蛛網纖維材料[2,3]。

聚丁內酰胺(PBL)的單體丁內酰胺可由生物質發酵制備的谷氨酸合成，因而屬于生物基聚合物[4]。其生物降解性已在堆肥、活性污泥、海水甚至體內實驗中得到驗證[5-11]。PBL 的熔點接近其分解溫度，熱穩定性差，嚴重限制了其熱加工及商業化。通過靜電紡絲技術制備PBL 纖維可促進PBL 在包括生物醫用材料在內的多個領域的應用。

CS 是目前被發現的唯一的天然陽離子聚合物，具有出色的生物降解性、生物相容性、抗菌性能和細胞黏附性能[12]。由于CS 鏈上同種電荷的排斥作用，CS 混合液的靜電紡絲難以實現，通常需與其他聚合物共混才能實現靜電紡絲，從而廣泛用于各種制藥和生物醫學領域[13-15]。

目前用于紡制納米蛛網纖維材料的合成材料力學性能較好，但因來源于化石基原料且不可降解，主要用于制備濾材。由天然大分子制備的納米蛛網纖維材料盡管生物相容性較好，可用于制備組織工程支架，但又存在力學性能方面的缺陷。僅有的納米蛛網復合纖維膜均使用聚酰胺6 與CS、卵磷脂復配，破壞了降解性能。本文以合成PBL 和天然CS 為原料，通過共溶劑實現了PBL/CS 靜電紡絲，制備了生物基可降解納米蛛網復合纖維膜，探討了兩者比例和混合液濃度對紡絲混合液性質、纖維形貌、聚集態結構以及形成納米蛛網能力的影響，考察了電紡納米蛛網纖維膜的細胞增殖性能。

1 實驗部分

1.1 原料與設備

PBL：黏均分子量Mη= 4.5×104，根據文獻[16,17]由丁內酰胺（w=99%，恒天生物基材料工程技術（寧波）有限公司）經開環聚合自行制備；CS：Mη=3.0×103，阿達瑪斯試劑有限公司；甲酸（FA）：w=88%，上海泰坦科技有限公司；小鼠成肌（C2C12）細胞：上海博湖生物科技有限公司；MTT 細胞增殖檢測試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 測試與表征

高壓直流電源:東文高壓電源（天津）股份有限公司DW-P503-1 型；注射泵：保定申辰泵業有限公司SPLab01-E 型；掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司S-4 800 型，纖維膜噴金處理后通過SEM 記錄纖維形態，在SEM 照片中分別選取50 根支架纖維和50 根納米蛛網纖維，用Image-pro Plus 5.0 圖像分析軟件計算兩種纖維的平均尺寸，并采用該軟件在SEM 照片中圈出存在納米蛛網纖維的區域，以其面積占整體圖片面積的百分比為蛛網覆蓋率；X 射線衍射(XRD)儀：日本理學電機D/max2550VB/PC 型，在室溫下采用Cu-Kα 輻射管（λ=0.154 nm），電流為40 mA，電壓為40 kV，掃描范圍為5°～55°；傅里葉紅外光譜（FT-IR）：美國熱電公司Nicolet 5 700 型，用溴化鉀壓片法制備測試樣品，測試范圍為4 000～400 cm-1；電導率儀：上海儀電科學儀器股份有限公司DDBJ-350 型，將電導率儀石墨電極浸入紡絲混合液至少30 mm 深，維持至少1 min，測量混合液電導率；旋轉流變儀：奧地利安東帕公司MCR 302 型，25 ℃下在錐板流變儀上測定混合液黏度，使用帶有環境箱的Peltier 平臺防止溶劑蒸發。

細胞親和性測試：將纖維膜超凈臺滅菌24 h 后，置于24 孔板內加入培養基浸泡24 h。用移液槍吸去培養基，每孔接種3×104個細胞（1 mL），加一組空白對照實驗，置于37 ℃培養箱內培養3d。用移液槍吸取浸泡纖維膜24h后的浸漬液加入96 孔板，每孔接種1×104個細胞（500 μL），置于37 °C 培養箱內培養3d。每孔加入MTT 工作液100 μL，放入37 °C 培養箱繼續培養4 h 后，吸去培養基，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液，放入振蕩箱振蕩15 min 溶解結晶。每孔取100 μL 加入96 孔板放置于酶標儀上，檢測其在570 nm 波長處的光密度（OD）。根據實驗組與對照組OD 比值得到細胞存活率。

活/死細胞染色（Live/Dead）試劑盒測試：利用試劑盒對附著在纖維膜上的細胞進行熒光染色。細胞試劑盒含有鈣黃素 AM 和碘化丙啶溶液，可分別染色活細胞和死細胞。其實驗過程與細胞親和性測試相同，最后獲得37 ℃培養箱內培養3d的實驗測試樣品。將鈣黃素 AM 和碘化丙啶溶液加入到纖維膜表面后，通過倒置熒光顯微鏡獲得細胞熒光照片。

1.3 PBL/CS 共混纖維膜的制備

將PBL 和CS 按照一定比例溶解在甲酸中，配制成混合液，超聲振蕩 30 min 充分溶解，再靜置30 min 脫除氣泡后進行靜電紡絲。紡絲電壓25 kV，混合液流速1.0 mL/h，接收距離15 cm。

2 結果與討論

2.1 纖維膜形貌

固定PBL/CS 甲酸混合液中聚合物總質量分數（wp）為8.0 %，圖1 為該混合液中CS 的質量分數（w（CS）=m（CS）∶m（CS+PBL）,下文同）對復合纖維膜形貌的影響。圖1（a～c）為PBL/CS 復合電紡膜的SEM照片，相應的纖維直徑分布統計如圖1（a1～c1）所示。混合液的電導率（σ）及黏度（η），以及電紡纖維膜的相關性質列于表1。由圖可見，增加w（CS），纖維膜中纖維粗細不均勻，直徑分布在10 ～300 nm，且均非納米蛛網結構。如表1 所示，當w（CS）=0 時，由于甲酸對PBL 氫鍵作用破壞較強，混合液黏度較低，只有0.46 Pa·s，不足以使混合液在噴頭處形成穩定的泰勒錐，且電導率相對較低，因而最終在靜電場力和重力的共同作用下，混合液滴落形成球形顆粒，得不到連續纖維。隨著PBL/CS 甲酸混合液中w（CS）的增加，接收板上可收集到不同粗細的纖維，纖維膜的孔隙率（P）隨之增加。當w（CS）=10%時，纖維平均直徑（D）為 90 nm。當w（CS）=20%時，纖維平均直徑減少至 72 nm。相較于w（CS）=10% 的情形，當w（CS）=20% 時混合液的黏度由1.85 Pa·s 提高到4.77 Pa·s，且CS 分子鏈上質子化氨基進一步增加了混合液電荷密度，混合液的電導率由4.21 mS/cm 增加至5.14 mS/cm，在高電場中射流得以充分劈裂和拉伸，形成更細的纖維。當w（CS）=30%時，纖維平均直徑增加至94 nm。此時，雖然混合液電導率和黏度均增加，但黏度的增幅更大，使纖維重新變粗。由表1 數據可知，增加w（CS）引起的混合液黏度增幅遠大于電導率的增幅。一般而言，混合液黏度增加會使纖維變粗，而電導率的增加則使纖維變細。增加w（CS）對纖維平均直徑影響不大，表明混合液電導率小幅度增長制約了黏度大幅度增長帶來的直徑增粗效應，亦即在PBL/CS 的甲酸混合液體系中，如要改變纖維直徑，大幅度改變電導率將比改變混合液黏度更為有效。

圖1 PBL/CS 纖維膜的形貌：（a～c）纖維膜的SEM 照片；（a1～c1）纖維的直徑分布圖Fig. 1 Morphology of PBL/CS composite fiber membranes: (a—c) SEM images of fiber membranes; (a1—c1) Diameter distribution of fiber

表1 w（CS）對混合液及纖維膜性質的影響Table 1 Influence of w(CS) on the properties of solutions and fiber membranes

圖2（a～c）分別為不同wp條件下所得纖維膜的SEM 照片，對應支架纖維的直徑分布圖如圖2（a1～c1）所示。圖2（b2，c2）分別為圖2（b，c）中蛛網纖維的直徑分布。混合液及纖維膜的性質列于表2 中。如圖2（a）所示，當w（CS）=10 %、wp=9.0 %時，纖維直徑分布均勻，存在少量串珠，纖維直徑約 61 nm，未出現納米蛛網結構。如圖2（b）所示，當wp=10.0 %，w（CS）=20 %時，纖維膜中串珠消失，出現少量納米蛛網結構，支架纖維平均直徑為 140 nm，納米蛛網纖維平均直徑13 nm，蛛網覆蓋率僅約10%，同時蛛網纖維存在斷頭。如圖2（c）所示，當wp=11.0 %、w（CS）=30%時，納米蛛網纖維斷頭消失，網狀結構發展充分并變得密集，部分區域黏連成薄膜，覆蓋率達 100%，支架纖維直徑繼續增加到 164 nm，納米蛛網纖維平均直徑減小到10 nm。

表2 不同混合液濃度對混合液及復合纖維膜性質的影響Table 2 Effect of wp on the properties of solutions and fiber membranes

表3 為不同w（CS）下wp的變化對電導率及黏度增幅的影響。由表3 數據可知，增加wp引起的黏度增幅小于電導率的增幅。由前述分析可知，在PBL/CS 的甲酸混合液中，電導率對纖維直徑的影響更大，當其增幅大于黏度的增幅時，可形成更多帶電射流和微小液滴，且這些微小液滴在電場中飛行時隨溶劑揮發發生相分離，形成的濃相在溶劑揮發后得到相互連接的納米蛛網纖維主體，而稀相則成為納米蛛網膜上的孔洞[18]。圖2（c）中白色箭頭指示的納米蛛網中部分黏連薄膜是由未完成相分離的微小液滴形成的。

表3 wp 對電導率及黏度增幅的影響Table 3 Effect of wp on the increase of solution conductivity and viscosity

圖2 PBL/CS 復合纖維膜的形貌：（a～c） PBL/CS 復合纖維膜的SEM 照片；（a1～c1）支架纖維的直徑分布；（b2，c2）（b，c）中蛛網纖維的直徑分布Fig. 2 Morphology of PBL/CS composite fiber membranes: （a—c） SEM images of samples; （a1—c1） Diameter distribution of samples;（b2—c2） Diameter distribution of nano-cobweb fibers in (b，c), respectively

2.2 纖維膜結構

圖3 為PBL/CS 復合纖維膜樣品的紅外譜圖。譜圖中在3 300 cm-1處為N―H 的伸縮振動峰，3 070 cm-1處為的偶合振動峰，2 935 cm-1處為PBL 上―CH2―的伸縮振動峰，2 860 cm-1處為―CH―的伸縮振動峰，1 643 cm-1處為C=O 的伸縮振動（酰胺I）峰，1 546 cm-1處為N―H 的彎曲振動（酰胺II）峰，1 080 cm-1處特征峰歸屬于CS 的六元環。由圖可見，隨著w（CS）的增加，3 300 cm-1處的N―H 伸縮振動峰強和1 546 cm-1處的N―H 彎曲振動峰強明顯減弱，表明CS 破壞了PBL 分子鏈間的氫鍵相互作用，而在PBL 與CS 之間形成了新的氫鍵相互作用[19,20]。

圖3 PBL/CS 復合纖維膜的FT-IR 譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of PBL/CS composite fiber membranes

圖4 為復合纖維膜樣品的XRD 曲線。如前所述，在本文所使用的電紡條件下無法紡制純PBL 纖維，圖4（a）中純PBL 纖維在流速2.5 mL/h、電壓36 kV 條件下紡制。純PBL 纖維在2θ=20.6°，24.4°處出現了聚酰胺α-晶型特征峰，與文獻[21]報道結果相同。PBL/CS 纖維膜中這兩個結晶峰峰強大大削弱，甚至消失。一方面可能是由于電紡過程中溶劑快速揮發，PBL 及CS 分子鏈來不及做規整堆砌，導致結晶度降低;另一方面，CS 鏈上的羥基、氨基及醚鍵會與PBL 鏈上的羰基和氨基形成新的氫鍵作用，從而抑制各自鏈段的有序排列，也會造成結晶度降低。

圖4 PBL/CS 復合纖維膜及PBL 粉末的XRD 譜圖Fig. 4 XRD patterns of PBL powder and PBL/CS composite fiber membranes

2.3 纖維膜的生物性能

圖5 為PBL/CS 纖維膜對C2C12 細胞活性影響的MTT 實驗結果。圖5（a）直接MTT 實驗結果顯示，不同wp復合纖維膜的細胞存活率均接近空白對照組，表明PBL/CS 復合纖維膜沒有細胞毒性，有利于細胞生長。圖5（b）間接MTT 實驗結果表明，當wp=11.0 %時，纖維膜浸漬液中細胞活力值為84 %，但仍屬于無毒性安全范圍。推測這是由于wp較高，制得的支架纖維較粗，纖維膜中存在少量未揮發掉的溶劑甲酸，浸漬過程中滲透進浸漬液，從而對細胞造成一定毒害。

圖6 是種植細胞的PBL/CS 復合纖維膜的體外熒光照片。由圖可見，種植在纖維膜上的細胞在實驗過程中未凋亡（凋亡細胞呈現紅色）。納米蛛網結構復合纖維膜上的細胞大多呈現紡錘型，而不是圓形，表明細胞較好地黏附在纖維上。這是由于具有納米構建體的膜表面為蛋白質的吸附提供了更大的表面積，存在更多與細胞膜受體的結合位點。上述結果表明，納米蛛網結構的PBL/CS 復合纖維膜無細胞毒性，并具有良好的細胞親和性，可促進細胞在其上的增殖。

3 結 論

（1）通過PBL/CS 甲酸混合液靜電紡絲制備了生物基可降解納米蛛網復合纖維膜。

（2）在PBL/CS 的甲酸混合液體系中，相比增加混合液黏度，在w（CS）不變時，提高wp可大幅提升混合液電導率，從而有利于制得納米蛛網結構的復合纖維膜。

（3）PBL/CS 復合纖維膜中，纖維的結晶度低，屬于無定形狀態。

（4）PBL/CS 納米蛛網復合纖維膜可促進細胞在其上的增殖，有望應用于傷口敷料、組織工程支架等領域。