手性三唑類殺菌劑氟環唑對土壤微生物的立體選擇性影響

薛鵬飛，劉瀟威 ，趙劉清，賀澤英 *

（1.農業農村部農產品質量安全環境因子控制重點實驗室，天津 300191；2.農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191）

氟環唑是世界范圍內最暢銷的三唑類殺菌劑之一，用于預防和治療水果、蔬菜、茶和谷物中的各種真菌病害。其作用機理是阻礙病原菌中鐵卟啉鐵氧絡合物的形成，進而強烈地抑制麥角甾醇的生物合成，從而達到抑制病原菌細胞膜合成的目的。氟環唑分子具有2個手性中心，4種立體異構體，其商業化產品順式-氟環唑外消旋體含有一對具有2R，3S-（+）-和2S，3R-（-）-構型的對映體（圖1）。在提高農作物產量的同時，未被有效利用的氟環唑會進入土壤和水體，且其降解非常緩慢，降解半衰期根據不同的環境類型、特性和條件從幾周到2 a以上不等。有關氟環唑在土壤中的持久性殘留對土壤微生物的影響報道較少，其不同對映體對土壤環境的潛在威脅值得關注。

圖1 順式-氟環唑不同對映體結構式Figure 1 The structure of different enantiomers of cis-epoxiconazole

土壤微生物在維持土壤質量和作物產量方面有著至關重要的作用。然而，農藥殘留可能會對土壤微生物生物量和活性，以及非靶標微生物的生物多樣性產生負面影響。近年來，已有三唑類殺菌劑對土壤細菌和非靶標真菌影響的研究報道。四氟醚唑的施用可顯著改變蘋果園土壤的微生物群落結構。戊唑醇顯著降低了研究結束時土壤中氨氧化細菌和古細菌的相對豐度，而對硫氧化細菌表現出試驗期間持續減少的趨勢。對于丙環唑，土壤微生物生長和土壤酶活性表現出濃度依賴性反應，即低濃度的丙環唑促進土壤微生物的生長，而高濃度的丙環唑抑制微生物生長。以上研究都是針對農藥外消旋體，而對于包括三唑類殺菌劑在內的手性農藥，其生物活性、吸附、轉移降解、對非靶標生物的毒性等均存在較強的對映體選擇性。對于氟環唑，其（+）-對映體比（-）-對映體在土壤中的降解半衰期更長，生物活性更高，環境毒性（對大型蚤）也更高。同時，在蔬菜-土壤-蚯蚓系統中氟環唑存在較顯著的立體選擇性富集和降解。三唑類殺菌劑對非靶標生物存在潛在的影響，然而土壤微生物對氟環唑的對映體選擇性響應尚未見報道。

目前基于高分辨質譜的代謝組學技術和基于高通量測序的微生物組學技術得到了廣泛的應用，已成為評估污染物對土壤微生物影響的有效技術手段。為了探究氟環唑及其不同對映體暴露下土壤微生物群落組成和代謝的立體選擇性響應，本研究基于非靶向代謝組學和微生物組學兩大組學聯合技術，通過土壤代謝組、系統發育樹重建與PICRUSt基因功能預測來研究土壤微生物的立體選擇性響應機制，為手性農藥環境殘留風險評估提供有力的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

氟環唑含量分析使用超高效液相色譜三重四極桿質譜儀，Waters UHPLC系統串聯QTRAP 4500（美國Sciex公司）；非靶向代謝組學分析采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜儀（QTOF 6600，美國Sciex公司）。其他儀器包括自動管磨機（IKA，德國），渦旋振蕩儀（Thermo，美國），高速離心機（Heal Force，中國香港）。

氟環唑[（±）-，純度99.9%]、2S，3R-氟環唑[（-）-，對映體純度>98%]和2R，3S-氟環唑[（+）-，對映體純度>98%]購自上海勤路生物技術有限公司（中國上海）。HPLC級的丙酮、甲醇、乙腈和乙酸乙酯購自Merck（德國）。甲酸和醋酸銨購自Sigma Aldrich（德國）。無水MgSO、分散固相萃取吸附劑C18和PSA購自Agilent公司（美國）。水由Milli-Q系統制備。

1.2 實驗設計

農田表層土壤（5~20 cm）取自天津市（117°27′E，38°90′N），土壤至少5 a未施用氟環唑。土壤在室溫下風干，過2 mm篩。供試土壤為壤土（黏粒18.43%、沙粒50.04%、粉粒31.01%），pH值為7.81，總有機碳（TOC）、總氮、總磷含量分別為19 970、140.1 mg·kg和445 mg·kg。實驗設計對照（CK）和（±）-、（-）-、（+）-氟環唑染毒共4個處理組，每組6個重復。染毒采用分步添加法，以確保染毒均勻。首先，在連續攪拌下將1 mL氟環唑丙酮溶液標品（2 mg·mL）緩慢加入到20 g土壤中，將初步染毒的土壤置于通風櫥中過夜以揮發溶劑。然后加入80 g空白土壤徹底混合，最終氟環唑添加水平為20 mg·kg。最后，加水使土壤水分含量為18%。對照土壤使用等量的丙酮溶液，其他步驟相同。將土壤在20℃下避光培養4周，然后對氟環唑含量、土壤性質、土壤微生物組成和土壤代謝物進行取樣測定。將所有土壤分為4份：兩份在-80℃保存用于測定土壤微生物組成和土壤代謝物，第三份在-20℃保存用于測定氟環唑含量，最后一份干燥后用于測定土壤性質。

1.3 氟環唑含量測定

氟環唑及其對映體的提取采用改進的QuECh?ERS法。稱取5 g土壤至50 mL塑料離心管中，加入5 mL去離子水使樣品水化30 min。加入20 mL乙腈和一個陶瓷均質子，渦旋萃取3 min。提取后，加入5 g NaCl，將離心管劇烈振蕩數次，5 000 r·min離心 5 min。取上清液6 mL轉移至裝有分散固相萃取吸附劑（900 mg MgSO、150 mg C18 和150 mg PSA）的15 mL離心管中，渦旋1 min，取上清液通過PTFE微孔濾膜（0.22 μm）裝入進樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

氟環唑及其對映體分離使用Lux 3u Cellulose-1手性色譜柱（150 mm×2.0 mm，3 μm，Phenomenex，美國）。儀器參數為：離子噴霧電壓（ISVF）5 500 V；溫度500 ℃；霧化氣（GS1）3.45×10Pa；加熱氣（GS2）3.45 × 10Pa；氣 簾 氣（CUR）2.07 × 10Pa；碰 撞 氣（CAD）中等。多反應監測（MRM）離子對以及相應參數見表1。

表1 氟環唑的質譜法參數Table 1 Mass spectrometric method parameters of epoxiconazole

液相條件：柱溫40 ℃，流速0.45 mL·min，進樣體積2 μL。流動相A為水相，含有2 mmol·L醋酸銨，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序為：0~2 min，50% B；2~3.2 min，梯度增加至65% B；3.2~4.6 min，保持65% B；4.6~6 min，梯度下降至50% B；6~8 min，保留50% B。

1.4 非靶向土壤代謝組學

土壤代謝物的提取參照先前的研究并進行了一些修改。取液氮研磨土壤樣品2 g于塑料離心管中，加入2 mL提取溶劑（甲醇∶HO=3∶1，/）和1 mL乙酸乙酯。將離心管渦旋3 min，然后超聲（冰?。┨崛? min。樣品離心（7 012，4℃）15 min，將上清液轉移至新管中，以上提取過程重復3次，將所有上清液混合后在40℃水浴中氮氣吹干，殘渣再溶解于0.5 mL萃取溶劑中，通過PTFE微孔濾膜（0.22 μm）進行代謝組學分析。

質量控制（QC）樣品通過混合所有樣品制備，以進行數據采集過程中的質量控制。每5個實際樣品進行一針QC樣品采集，分別進行正負源分析。高分辨篩選和定性分析在UPLC-QTOF-MS（Triple TOF 6600，SCIEX）中進行，使用Exion LC UPLC系統配備HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，100 ?，Waters，美國）色譜柱對樣品進行色譜分離。柱溫設置為50 °C，流速為0.3 mL·min，進樣量2 μL。流動相A為水相，含5 mol·L甲酸銨和0.1%的甲酸，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序為：0~1.5 min，3% B；1.5~11 min，增加到80%B；11~14 min，增加到97% B；14~18 min，保持97% B；18~18.1 min，降低至3% B；18.1~21 min，保持3% B。

質譜采集分別在ESI+和ESI?電離模式下進行。電噴霧電離（ESI）源參數為：離子噴霧電壓（ISVF）正離子模式5 500 V，負離子模式-4 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣（GS1）3.79×10Pa；加熱氣（GS2）3.79×10Pa；氣簾氣（CUR）2.41 × 10Pa。采用 T OF - MS（70~1 000/）-IDA-MS/MS（50~1 000/）模式在單次運行中同時獲得高分辨一級和二級全掃圖。在全掃描TOF-MS實驗中，去簇電壓（DP）為60 V，碰撞能（CE）為10 eV。IDA-MS/MS標準：采集響應超過100 cps的離子；CE和碰撞能量擴散（CES）分別設置為35 eV和15 eV。

1.5 高通量微生物測序

1.5.1 細菌

使 用 E .Z.N.A.TM Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Doraville，美國）提取總基因組DNA，并儲存于-80℃待進一步分析。DNA濃度和純度使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國）測定。使用1%瓊脂糖凝膠通過電泳評估DNA提取的質量。使用V3~V4可變區引物進行PCR擴增，引物為：341F（5′ -CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和 8 06R（5′ - GGAC?TACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR擴增子用 A gen?court AMPure Beads（Beckman Coulter，美國）純化，并使用PicoGreen dsDNA檢測試劑盒（Invitrogen，美國）進行定量。在單獨的定量步驟之后，將等量的擴增子合并，并使用Illumina MiSeq平臺和MiSeq ReagentKit v3進行雙端2×300 bp測序。

1.5.2 真菌

使用 N ucleoSpinSoil試劑盒（Macherey-Nagel）提取總DNA，并通過分光光度法（novaseq 6000 PE250，Thermo Scientific）計算DNA濃度。使用引物基因 I TS3~2024F（5′-GCATCGATGAACGCAGC-3′）和ITS4~2409R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行內部轉錄間隔區（ITS2）的PCR擴增。擴增子用Agencourt AMPure XP試劑盒（Beckman Coulter，美國）清洗，用Qubit dsDNA HS檢測試劑盒（Life Technolo?gies）定量，等量合并后使用EZNA Cycle Pure試劑盒（Omega Bio-泰克）進行測序。

1.6 多元統計分析

代謝組學原始數據使用SCIEX OS（SCIEX，美國）軟件處理分析，并獲取質譜峰面積。使用MetaboAna?lyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）對代謝組學數據進行多變量統計分析，經標準化的數據進行單因子方差和熱圖分析。

擴增子序列變體（ASV）根據原始序列信息（FASTQ格式）使用QIIME2推薦的DADA2方法進行質量控制、去噪和去除嵌合體后得到。一個操作分類單元（OUT）使用RDP分類器進行注釋和分類，以獲得不同分類級別的編號。使用Kruskal-Wallis和DEseq2方法對組間和樣品間豐度進行差異分析，使用Benjamini-Hochberg方法調整值。由R語言ggtree包繪制物種系統進化樹，選取豐度最高的前50個屬。利用PICRUSt2對16S rRNA基因數據功能預測，并結合MetaCyc（https：//metacyc.org/）數據庫進行代謝通路比對。經注釋后的通路利用ANOVA和Duncan檢驗進行差異分析。其他不同分組間差異檢驗用SPSS 23.0完成。

2 結果與討論

2.1 氟環唑的立體選擇性降解

由表2可知，土壤培育4周后未觀察到氟環唑外消旋體及對映體的顯著降解。實驗結束時（+）-、（-）-和（±）-氟環唑的含量分別為（19.62±0.66）mg·kg、（18.63±1.43）mg·kg和（17.87±0.08）mg·kg，與原始含量無顯著差異（檢驗）。此外，通過氟環唑的EF（對映體分數）值，未觀察到顯著的對映體選擇性。

表2 土壤基本性質和氟環唑含量Table 2 Basic soil properties and epoxiconazole content

三唑類殺菌劑在土壤中的高持久性增加了其環境風險性。與氟環唑類似，其他三唑類殺菌劑在土壤中的降解半衰期也很長，如腈菌唑的半衰期為74~177 d、戊唑醇的半衰期為86~247 d、四氟醚唑的半衰期為69~87 d、苯醚甲環唑的半衰期為169~239 d，烯唑醇的半衰期為141~210 d。由于不同對映異構體的高持久性和不同環境行為，氟環唑對土壤微生物的對映體選擇性影響值得進一步探究。

圖2A顯示了不同處理組在門水平上的相對分布情況。相對豐度排在前20的細菌物種中，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）等是氟環唑暴露下土壤中的主要細菌。與CK相比，變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門等的相對豐度由于氟環唑及其對映體暴露而表現出明顯的視覺差異。對于真菌，ITS2基因測序揭示了真菌對氟環唑及其對映體的響應，不同處理組在門水平上的相對分布情況如圖2B所示。在相對豐度排名前20的真菌物種中，子囊菌門（Ascomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomyco?ta）、Aphelidiomycota門、羅茲菌門（Rozellomycota）等是氟環唑暴露下土壤中的主要真菌。與CK相比，氟環唑外消旋體和對映體暴露引起了土壤中子囊菌門、壺菌門、擔子菌門等在視覺上的明顯豐度差異。同時，變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、子囊菌門、壺菌門、擔子菌門等也是低灌木藍莓土壤在丙硫菌唑等殺菌劑暴露下的主要菌群，其會因多效唑的處理而發生明顯變化。

圖2 不同處理組對土壤門水平群落結構組成的影響Figure 2 Effects of different treatments on community structure at phylum level

氟環唑不同對映體暴露引起了部分細菌和真菌的相對豐度變化。研究表明，三唑類殺菌劑會引起土壤微生物的應激反應。多效唑可改變土壤細菌和真菌的群落組成，如綠彎菌門和壺菌門的相對豐度先增加后降低，酸桿菌門的相對豐度先降低后增加。苯醚甲環唑暴露引起了土壤細菌群落多樣性的下降，同時能顯著影響土壤中的細菌群落結構并表現出濃度依賴性。不同對映體引起的微生物群落變化不同，即土壤微生物群落對氟環唑表現出立體選擇性。

2.2 不同對映體暴露對土壤代謝組的影響

在不同對映體環境中，生物體的代謝物組成差異在分子水平上顯示出對手性化合物的立體選擇性代謝響應。土壤中的氟環唑可直接或間接與土壤微生物相互作用，進而影響土壤微生物群落的代謝。土壤有機質（SOM）由溶解的細胞、植物和微生物釋放的小分子代謝物組成。土壤微生物分泌的細胞內和細胞外代謝物構成了SOM的代謝物庫，因此監測土壤代謝物可以間接反映微生物代謝趨向的變化。通過使用基于LC-QTOF-MS的非靶向代謝組學，共篩查出281種代謝物。根據單因子方差分析獲取差異代謝物，相比于CK，共得到84種顯著差異代謝物（<0.05），表明氟環唑及其對映體暴露引起了土壤代謝組的顯著改變（圖3A）。圖3B為基于VIP分值的PLS-DA區分的代謝物熱圖，不同處理組熱圖聚類表現出明顯差異。（+）-處理引起了部分代謝物的顯著上調或下調，（-）-處理引起的變化較（+）-弱，同時（±）-也引起了不同程度的代謝物改變。不同對映體表現出的聚類差異反映出由（+）-驅動的立體選擇性代謝響應。土壤代謝組的改變可能部分歸因于微生物被動釋放的細胞外化合物，以及基于SOM中的代謝物循環，氟環唑的暴露引起了土壤微生物群落組成和碳循環方式的改變。

圖3 單因素方差分析和基于VIP值的熱圖分析Figure 3 One-way ANOVA analysis and heatmap of the metabolites based on VIP values

2.3 不同對映體暴露的系統發育重建

2.3.1 細菌

圖4A為不同處理組細菌系統發育多樣性指數（Faith_pd）。經Wilcox檢驗，相比于CK、（-）-、（+）-，（±）-暴露的細菌系統發育多樣性指數顯著增加（<0.05），而其他組間兩兩比較的細菌系統發育多樣性指數變化不顯著（>0.05）。如圖5所示，細菌的系統發育進化樹及組間豐度分布熱圖結果顯示了不同處理的細菌相對豐度差異。其中，結腸桿菌（）、繡色土生單胞菌（）、綠藻（）具有最長的分支進化長度，結腸桿菌與屬可能同源。相比于CK處理組，硝化螺旋菌屬（）、費氏弧菌（）、羅氏菌屬（）、噬甲基菌屬（）等在（-）-處理土壤中相對豐度明顯增加；食草酸嗜氨菌（s）、龐氏桿菌（）、甲基營養型菌（）、綠膿桿菌（）等在（+）-處理土壤中相對豐度明顯增加；而（±）-暴露土壤中的布魯氏菌（）、繡色土生單胞菌、屬等相對豐度明顯增加。相比于CK處理，氟環唑外消旋體及對映體暴露顯著降低了鏈霉菌屬（）、甲基黃桿菌（）、羅爾斯通氏菌屬（）、固氮弧菌屬（）等的相對豐度。不同處理組的細菌系統進化物種組成明顯不同，表明土壤細菌功能基因對氟環唑的立體選擇性具有差異。這些被影響的細菌在門水平上主要為酸桿菌門、擬桿菌門、放線菌門等，這與陳麗君等的研究結果相同。殺菌劑和殺真菌劑可抑制大多數微生物生長，但它們對呼吸和氮循環有混合影響，其中戊唑醇表現出較強的負面作用。這可能與顯著改變的細菌，如與氮循環有關的硝化螺旋菌屬、食草酸嗜氨菌、固氮弧菌屬等通過呼吸和氮循環來減弱氧化脅迫過程有直接聯系。

圖4 Faith_pd指數的箱型圖Figure 4 Box plot of Faith_pd index

圖5 系統發育進化樹及組間豐度分布熱圖（細菌）Figure 5 Phylogenetic tree and heatmap of abundance distribution between groups（bacteria）

2.3.2 真菌

圖6系統發育進化樹及組間豐度分布熱圖（真菌）Figure 6 Phylogenetic tree and heatmap of abundance distribution between groups（fungi）

圖4B為不同處理組真菌系統發育多樣性指數（Faith_pd）。經Wilcox檢驗，相比于CK和（-）-，（±）-處理的真菌系統發育多樣性指數顯著減小（<0.01），而其他處理兩兩比較的真菌系統發育多樣性指數變化不顯著（>0.05）。如圖 6所示，鱗球菌（）、屬、交鏈孢霉屬（）具有較長的分支進化長度，枝頂孢霉屬（）與鱗球菌（）可能同源，出芽短梗霉（）與屬可能同源。與CK處理組相比，氟環唑外消旋體及對映體處理中的高豐度物種表現出明顯差異，如屬、毛殼屬（）、馬爾尼菲籃狀菌（）、油壺菌屬（）等僅在（-）-處理土壤中相對豐度明顯增加；白僵菌屬（）、孢霉屬（）、樹粉孢屬（）、絲膜菌屬（）等僅在（+）-處理土壤中相對豐度明顯增加；而（±）-處理土壤中，屬、疣彎孢霉（）、鏈格孢（）、被孢霉屬（）等相對豐度明顯增加。同時相比于CK處理，氟環唑處理顯著降低了互生頂孢霉（）、屬、念珠菌（）、玫瑰根霉菌（）等真菌的相對豐度。氟環唑外消旋體及對映體暴露的真菌系統進化物種組成明顯不同，并且存在立體選擇性差異。在門水平上，這些被影響的真菌主要為子囊菌門、擔子菌門、壺菌門等，多效唑也引起了這些真菌的顯著變化。土壤真菌，包括前面豐度顯著增加的細菌，對氟環唑在土壤中的降解起到了重要作用，部分微生物可將氟環唑作為碳源來維持自身生長，從而為土壤中微生物組成和數量的改變提供了可能。

2.4 不同對映體暴露下PICRUSt基因預測

2.4.1 細菌

PICRUSt基因預測分析應用于土壤細菌能較為準確地預測功能基因的存在與否及其豐度變化。通過PICRUSt預測和列舉不同處理組中顯著變化的細菌代謝通路，表現出功能上的豐富性，并基于Meta?Cyc數據庫比對出10條不同處理組間具有顯著生物學差異的代謝途徑（圖7）。在所列舉的代謝途徑中，氟環唑及其對映體暴露顯著增加了L-精氨酸降解Ⅱ（L-arginine degradationⅡ）、甲基萘醌-8生物合成超級通道Ⅱ（Superpathway of menaquinol-8 biosynthesisⅡ）、GDP-D-甘油-α-D-甘露庚糖生物合成（GDPD-glycero-α-D-manno-heptose biosynthesis）通路的功能基因豐度，顯著減少了甲基赤蘚糖醇磷酸途徑Ⅰ（Methylerythritol phosphate pathwayⅠ）、嘧啶脫氧核糖核苷酸從頭生物合成Ⅲ（Pyrimidine deoxyribonucle?otides de novo biosynthesisⅢ）、聚（甘油磷酸）壁磷壁酸生物合成[Poly（glycerol phosphate）wall teichoic acid biosynthesis]等通路的功能基因豐度。另外，除去甲亞精胺生物合成（Norspermidine biosynthesis）和聚（甘油磷酸）壁磷壁酸生物合成通路在兩對映體處理中的功能基因豐度差異不顯著外，其他途徑兩對映體均表現出顯著差異，并且（+）-氟環唑影響整體大于（-）-氟環唑。多效唑對芒果園土壤微生物的PICRUSt功能預測分析結果表明，多效唑處理會降低土壤細菌的整體代謝能力。氟環唑處理引起了農田土壤中細菌代謝功能的改變，并且（±）-和（+）-引起的差異水平大于（-）-，這種由（+）-驅動的對細菌功能基因的影響可能是（+）-毒性大于（-）-毒性的直接結果。

圖7 豐度顯著差異的MetaCyc通路（細菌）Figure 7 MetaCyc pathways with significant differences in abundance（bacteria）

2.4.2 真菌

根據PICRUSt預測結果，基于MetaCyc比對出22條不同處理組間具有顯著生物學差異的真菌功能基因代謝途徑（圖8），表現出了功能上的豐富性。三唑類殺菌劑的作用靶標是基于稻瘟病等植物疾病的病原真菌，因此被影響的真菌功能代謝途徑多于細菌。在所列舉的代謝途徑中，氟環唑及其對映體暴露增加了15條代謝途徑的功能基因豐度，降低了7條途徑的功能基因豐度。同時，氟環唑外消旋體能最大程度地引起功能基因豐度的增加或降低，如：L-蛋氨酸生物合成Ⅲ（L-methionine biosynthesisⅢ）、有氧呼吸Ⅰ（細胞色素c）（[Aerobic respirationⅠ（cytochrome c）]、蔗糖降解Ⅲ（Sucrose degradationⅢ）等途徑只在（±）-處理中被顯著影響（<0.05）。而嘧啶脫氧核糖核苷酸從頭生物合成Ⅰ（Pyrimidine deoxyribonucleo?tides de novo biosynthesisⅠ）、甲基酮生物合成（Meth?yl ketone biosynthesis）、腺苷核苷酸從頭生物合成的超通路Ⅱ（Superpathway of adenosine nucleotides de novo biosynthesisⅡ）等途徑在兩對映體處理中表現出顯著差異。表明氟環唑影響了土壤真菌的代謝功能，并且（±）-和（+）-引起的差異水平大于（-）-，這與在細菌中觀察到的結果相同。

圖8 豐度顯著差異的MetaCyc通路（真菌）Figure 8 MetaCyc pathways with significant differences in abundance（fungi）

基于PICRUSt的細菌和真菌功能基因的代謝途徑預測結果表明，氟環唑及其對映體處理均引起了細菌和真菌相關功能基因代謝水平的改變。（+）-驅動的立體選擇性響應表明微生物對氟環唑脅迫執行了一定的氧化應激（ROS）措施。有氧呼吸途徑在氟環唑及其對映體處理土壤中顯著增強，是由于土壤細菌和真菌通過增強呼吸強度促進了脅迫反應。與核糖核酸合成代謝有關的嘧啶、嘌呤、核苷和鳥苷等路徑是被影響最多的一類功能途徑。嘌呤和嘧啶代謝是控制細胞生化反應各個方面的重要因子，其發生改變可能與氟環唑處理有直接關系。這些功能的變化可能是因為微生物實施了與其他壓力相關功能過程重新分配能量和資源的策略。與能量循環（TCA）有關的糖代謝和氨基酸代謝過程也被影響，這可能與和跨膜運輸相關的蛋白質通道中的持續氧化應激有關。同時，聚（甘油磷酸）壁磷壁酸、脂肪酸β氧化和磷脂重塑過程是微生物為維持細胞膜完整性和細胞功能而對環境條件做出的直接反應。這些過程預示著磷脂脂肪酸（PLFA）的改變，這可能是由于氟環唑誘導了ROS的過度生成，ROS可以氧化微生物細胞膜上的脂肪酸；或者，微生物群落內的群體可能會主動調整其膜的PLFA組成，以響應氟環唑誘導的壓力?？傊h唑的暴露影響了農田土壤微生物群落相關功能基因的豐度，進而影響了微生物群落的生長代謝、信息傳遞等過程。

氟環唑及其對映體暴露后的農田土壤，在微生物群落的氧化應激過程中增強或減弱的代謝途徑加劇了土壤代謝組向著氟環唑不同單體環境改變，從而表現出立體選擇性，并且由（+）-驅動。值得注意的是，真菌群落比細菌群落對氟環唑的暴露更加敏感，氟環唑外消旋體更能引起土壤真菌代謝功能的改變?；诜前邢虼x組學、高通量測序結果的系統發育樹重建和PICRUSt基因預測的聯合分析，為三唑類殺菌劑氟環唑在農業土壤環境中的環境風險評估提供了有力的理論依據。

3 結論

（1）氟環唑在農田土壤中的降解不顯著，該暴露過程可引起土壤代謝組的改變，細菌和真菌群落組成的改變，以及PICRUSt基因預測代謝途徑的改變。

（2）PICRUSt基因功能預測結果表明，被影響的真菌功能代謝途徑多于細菌，氟環唑外消旋體及對映體對土壤細菌和真菌功能基因的影響表現為外消旋體和（+）-對映體引起的差異水平大于（-）-對映體。

（3）三唑類殺菌劑氟環唑在土壤微生物群落中的立體選擇性響應被揭示，并且在土壤代謝組、系統發育樹重建及其組間豐度分布和PICRUSt基因預測代謝通路中表現出由（+）-對映體引起的一致性差異。