液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中硝基呋喃類代謝物多殘留

倪瑞敏，張玉潔，王秀麗，都 穎

（威海市食品藥品檢驗檢測研究院，山東威海 264209）

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，可以殺滅大部分病原體，而且不容易產生耐藥性[1]。硝基呋喃類藥物曾在畜禽和水產品養殖行業廣泛應用，用來治療由沙門氏菌、大腸桿菌等引起的各種疾病[2]。硝基呋喃類藥物原型及其代謝物均對人體有致畸、致癌等毒副作用，目前，農業農村部公告第250號規定食品動物中禁止使用硝基呋喃類[3]。硝基呋喃類原型藥在生物體內代謝迅速，直接對其進行檢測無法反映其真實的殘留水平，但是其代謝產物易與蛋白質結合且相當穩定，故常利用代謝物的檢測來反應硝基呋喃類藥物的殘留狀況[4]。硝基呋喃代謝物的檢測主要利用液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫法等檢測技術。因液相色譜-串聯質譜法檢測靈敏度高、結果穩定、重現性好，被應用于硝基呋喃代謝物的檢測中[5]。農業部781號公告—4—2006被廣泛應用于動物源性食品硝基呋喃代謝物的檢測，本實驗是在農業部781號公告—4—2006的基礎上，分別對衍生過程、提取過程、定容過程進行優化。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Qtrap 6500液相色譜質譜聯用儀，美國AB SCIEX公司；恒溫水浴搖床，天津市泰斯特儀器有限公司；氮吹儀，廣州三研科技；渦旋振蕩器，重慶賽恩斯儀器有限公司；高速冷凍離心機，凱達科學儀器有限公司。

1.2 試劑和材料

呋喃唑酮（AOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥 因（AHD）、呋 喃 它 酮（AMOZ）、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-HCl-13C，15N2，標準品均為100 mg/L，購自壇墨質檢科技股份有限公司；2-硝基苯甲醛，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；二甲亞砜（分析純）、乙酸乙酯、磷酸氫二鉀（分析純）及鹽酸（分析純），阿拉丁。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確移取4種硝基呋喃代謝物標準溶液，用甲醇配制成濃度為1 mg/L的混合標準儲備液。使用前將混合標準儲備液逐級稀釋為100 μg/L和10 μg/L的混合標準工作液。內標混合標準儲備液制備方法同上，使用前將內標混合標準儲備液稀釋為100 μg/L的混合內標標準工作液。

1.3.2 樣品的前處理

稱取試樣2 g(精確至±0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 50%的甲醇水溶液，振蕩 10 min，5000 r/min離心5 min，棄去液體。殘留物中準確加入混合內標標準工作液50 μL，渦旋混合30 s，加入5 mL 0.5 mol/L的鹽酸溶液，0.5 mL 0.05 mol/L的2-硝基苯甲醛溶液，渦旋混合1 min，置于恒溫振蕩器中，37 ℃避光振蕩16 h。取離心凈化管冷卻至室溫，加入5 mL磷酸氫二鉀溶液，調節pH值至7.2～7.4，加乙酸乙酯10 mL，渦旋振蕩 1 min，10000 r/min離心5 min，取上清液至離心管中，40 ℃氮氣吹干。加5%甲醇溶液1.0 mL溶解殘留物，加入2 mL正己烷去除油脂，以12000 r/min的轉速離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜分析。

1.3.3 標準曲線的制備

分別準確移取10 ng/mL混合標準工作溶液 0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和 2.00 mL于6個50 mL離心管中，除不加樣品外，按1.3.2步驟操作。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜參考條件

色 譜 柱：C18，[150 mm×2.0 mm（id），5 μm]； 流速：0.3 mL/min；

柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；流動相A為 0.002 mol/L乙酸銨溶液；流動相B為甲醇。洗脫程序見表1。

表1 液相色譜洗脫條件

1.4.2 質譜參考條件

離子源位電噴霧離子源，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應監測。相關參數見表2。

表2 多反應監測的條件

2 結果與分析

2.1 衍生過程的優化

農 業 部781號 公 告—4—2006使 用150 μL 50 mmol/L的2-硝基苯甲醛，0.5 mL 1 mol/L的鹽酸，實驗結果顯示該方法衍生化不夠充分，標準曲線的線性效果較差。主要原因可能是2-硝基苯甲醛用量過少，導致衍生效果不好，鹽酸用量少，導致樣品混合不均勻，并且酸性程度低，導致反應不夠充分，標準曲線的線性結果不佳[6]。優化后，加入500 μL 50 mmol/L的2-硝基苯甲醛，5 mL 0.5 mol/L的鹽酸，結果穩定，重復性好，回收率得到提高，且標準曲線的線性效果得到優化。

2.2 提取過程的優化

農業部781號公告—4—2006使用5 mL乙酸乙酯重復提取兩次，操作煩瑣，消耗時間過長，優化后，加入10 mL乙酸乙酯提取一次，不會影響回收率，可以極大節約提取時間，提高工作效率，對于實驗室批量化檢測具有良好的現實意義。781號公告—4—2006離心時的轉速為2000 r/min，離心15 min，實驗顯示離心轉速較低，離心效果差，上清液比較渾濁，從而影響目標物的提取效果[7]。此外，離心時間過長，還增加了檢測時間。優化后，離心轉速為10000 r/min，離心5 min，提高轉速后，離心效果更好，分層更加明顯，上清液更加澄清，同時減少離心時間有效壓縮了檢測時間，提高了檢測效率。

2.3 定容過程的優化

農業部781號公告—4—2006定容時直接使用20%甲醇水0.5 mL溶解殘余物，沒有去除油脂的步驟。但是實際操作過程中動物肌肉、內臟等樣品往往含有很多油脂，易造成基質效應，直接進樣會影響色譜柱的壽命[8]。改進后，加入飽和的正己烷去除油脂，可以減少基質對目標物的干擾，提高檢測的靈敏度，降低對色譜柱和儀器的損害。781號公告—4—2006使用的是0.45 μm的濾膜，濾膜的孔徑較大，一些大分子物質可能通過濾膜進入到樣品檢測中，優化后，使用0.22 μm的濾膜，有利于去除更多的大分子物質，減少對目標物的干擾。

2.4 硝基呋喃代謝物的標準曲線

按照1.3.3方法制備標準曲線，在本研究的色譜和質譜條件下進行測定，結果發現AOZ、AHD、SEM及AMOZ衍生物在0.5～20.0 ng/mL線性系數良好，相關系數均大于0.99，4種硝基呋喃類代謝物的檢出限均為0.25 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。線性方程及檢出限、定量限見表3。

表3 4種硝基呋喃類代謝物的線性方程及相關系數

2.5 方法回收率和精密度

在2 g陰性豬肉樣品中分別添加濃度為 10 ng/mL的4種硝基呋喃代謝物混合標準溶液 0 mL、10.00 mL、0.20 mL和1.00 mL，4種硝基呋喃代謝物的添加水平分別為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg，按1.3.2進行提取和凈化，每個添加水平平行測定6次，回收率和精密度見表4。AOZ、AHD、SEM及AMOZ代謝物的回收率分別為92.0%～99.2%、86.0%～96.4%、90.0%～98.4%及82.0%～93.6%，RSD為1.8%～8.8%。該方法的回收率與精密度可以滿足相關規定以及批量化檢測的要求。

表4 不同濃度添加水平下的回收率和精密度

3 結論

本實驗對農業部781號公告—4—2006進行以下優化：①增加2-硝基苯甲醛用量，使衍生更完全； ②增加鹽酸用量，樣品混合更充分，衍生化更充分；③增加乙酸乙酯用量，減少提取時間，提高工作效率；④提高離心轉速后分層更加明顯，上清液更加澄清；⑤使用正己烷去除油脂后，可以降低基質對目標物的影響；⑥使用0.22 μm濾膜可以去除更多的大分子物質，減少對目標物的干擾。

本文建立了一種用于測定動物源性食品中硝基呋喃類代謝物多殘留的液相色譜-串聯質譜的分析方法。結果表明，在0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg 3個添加水平，AOZ、AHD、SEM及AMOZ代謝物的平均回收率為88.2%～95.4%，相對標準偏差為1.8%～8.8%，方法檢出限為0.25 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg。各項指標均能滿足動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定要求，方法結果準確、穩定性高，為快速檢測動物源性食品中硝基呋喃類代謝物殘留提供了支持。