超高效液相色譜-串聯質譜法測定淡水養殖 用水中25種抗生素

李小梅，李麗珍，何春慧，張麗姬，王河丹，吳學貴

（海南威爾檢測技術有限公司，海南澄邁 571924）

抗生素類種類繁多，在人們的防治感染性疾病和動物的抗菌促生長等方面應用較廣。抗生素濫用或過度使用會導致人和動物對其產生耐藥性[1]。在水產養殖中，抗生素的作用主要是預防和治療疾病，提高水產動物的存活率[2]。因此，在全球的水產養殖業中，抗生素被大量使用，對人體健康造成一定危害[3]。本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法[4]檢測淡水養殖用水中的25種抗生素類殘留檢測，為檢測淡水養殖用水中磺胺類和喹諾酮類抗生素殘留提供可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲二唑、磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶標準品（純度均≥97.00%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；鹽酸（優級純，廣州牌化學試劑）；甲醇、乙腈（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；Oasis HLB小柱（Waters公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent1290/G6470A超高效液相色譜-串聯質譜（美國Agilent Technologies公司）；AB204-S電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TTLDCII氮吹儀（北京同泰聯科技發展有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取500 mL過濾后的淡水養殖用水水樣用鹽酸溶液酸化后，加入乙二胺四乙酸二鈉200 mg，混勻后過HBL小柱凈化、提取，用12 mL甲醇洗脫，洗脫液吹至近干，加入1 mL流動相（0.5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸溶液∶乙腈=9∶1），混勻后過濾膜，濾液供超高效液相色譜-串聯質譜儀分析。

1.3.2 標準工作溶液的配制

分別準確稱取25種抗生素固體標準品10.0 mg，加入適量甲醇超聲溶解，配制成質量濃度為10 mg/L的標準儲備溶液，待用。移取適量10 mg/L的標準儲備溶液，用甲醇稀釋成0.1 mg/L的標準中間液。用流動相（0.5 mmol乙酸銨 -0.1% 甲酸溶液∶乙腈 = 9 ∶ 1）稀釋標準中間液，分別配制成質量濃度為 0.1 ng/L、0.5 ng/L、1.0 ng/L、2.0 ng/L、5.0 ng/L、10.0 ng/L、25.0 ng/L和50.0 ng/L的標準工作溶液。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相A為0.5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0 min，95%A，3.5 min時，88%A，4.0 min時，86%A，7.0 min時，63%A，7.1 min時，5%A，8.7 min時，5%A，8.8 min時，95%A；流速：0.3 mL/min。

（2）質譜條件。離子源為電噴霧離子源AJS ESI，正離子模式；毛細管電壓：4000 V；離子源溫度：300 ℃；鞘氣溫度：350 ℃；檢測方式為多反應監測。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

參考2008年農業部發布的《水產品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[5]磺胺類和喹諾酮類檢測方法，本文用鹽酸溶液和氨水調節水樣pH為酸性2.5、弱酸性5.2和近中性7.7，研究水質酸堿度對回收率的影響，每個樣品在不同pH條件下平行加標6個，濃度為 10 ng/L，結果見表1。實驗表明pH為2.5時，平均回收率較高且相對穩定。因此，本文選擇將淡水養殖用水pH調節為2.5進行實驗。

表1 不同pH條件下藥物的平均回收率及RSD（單位：%）

2.2 標準曲線繪制

按照優化后的條件和方法對標準工作溶液進行分析測定，以目標化合物標準溶液濃度為橫坐標x、峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線。25種抗生素藥物的線性關系見表2，相關系數為0.99061～0.99983。

表2 抗生素藥物的線性方程

2.3 方法檢出限

用陰性樣品加標處理，用流動相稀釋混合標準溶液，以信噪比（S/N）=3為方法檢出限。如圖1所示，淡水養殖用水中磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、氧氟沙星和環丙沙星5種抗生素檢出限為 0.1 ng/L，磺胺甲惡唑、恩諾沙星、丹諾沙星和氟甲喹4種抗生素檢出限為0.2 ng/L，甲氧芐啶、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺吡啶、雙氟沙星、洛美沙星和培氟沙星8種抗生素檢出限為0.5 ng/L，磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺異惡唑、諾氟沙星和沙拉沙星8種抗生素的檢出限為1.0 ng/L。因此，該方法的檢測靈敏度較高。

圖1 淡水養殖用水中25種抗生素檢出限

2.4 回收率與精密度實驗

本文選擇將淡水養殖用水pH調節為2.5進行實驗，采用加標回收法進行回收率和精密度實驗，分別計算出的磺胺類藥物平均回收率為100.7%～115.4%，RSD為1.05%～4.69%，喹諾酮類藥物平均回收率為90.1%～111.0%，RSD為2.20%～9.55%，各項指標均符合要求。

2.5 樣品檢測

按照優化后的實驗條件對4處淡水養殖用水中25種抗生素進行檢測。如圖2所示，淡水養殖用水中25種抗生素在8 min內全部出峰，出峰時間較快，提高了檢測效率。

圖2 淡水養殖用水中25種抗生素出峰時間

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜法對淡水養殖用水中25種抗生素進行檢測，該方法25種抗生素出峰時間快，檢出限為0.1～1.0 ng/L，相關系數為0.99061～0.99983，磺胺類藥物平均回收率為100.7%～115.4%，RSD為1.05%～4.69%，喹諾酮類藥物平均回收率為90.1%～111.0%，RSD為2.20%～9.55%。該方法快速、穩定、靈敏度和準確度高，適用于淡水養殖用水中磺胺類和喹諾酮類藥物檢測。