不同鹽度水平對(duì)金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓線粒體豐富細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

劉鑒毅，余焱方，馮廣朋，趙 峰，孫雪娜，王 妤，鄒 雄，黃曉榮，李 琪，孫艷秋

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長(zhǎng)江口漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，上海 200090）

廣鹽性硬骨魚(yú)類為了適應(yīng)外界環(huán)境鹽度驟變，通過(guò)調(diào)節(jié)鰓絲上皮中線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量、分布、形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，不同亞型之間通過(guò)可逆性的轉(zhuǎn)變進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，以維持內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定［1］。一般與魚(yú)類滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的生理生化研究，主要涉及鰓和腎臟等滲透調(diào)節(jié)器官的組織形態(tài)變化，研究指標(biāo)包括Na＋／K＋-ATPase活性、血清（漿）的滲透壓、離子濃度和激素濃度的變化［2］。鰓是硬骨魚(yú)類進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的重要器官，具有維持內(nèi)外滲透平衡、離子的分泌和吸收、pH以及排泄氨氮等功能［3-4］。

水環(huán)境鹽度的改變會(huì)破壞魚(yú)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，不僅會(huì)造成組織器官損壞、滲透條件功能喪失，而且會(huì)影響其存活和生長(zhǎng)［5-6］，在不同鹽度海水環(huán)境下鰓線粒體豐富細(xì)胞主要發(fā)揮離子吸收和離子分泌的作用，在低滲條件下向外界分泌氯離子（Cl-），高滲條件下分泌和吸收鈉離子（Na＋）、鉀離子（K＋）的離子雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其數(shù)量和形態(tài)大小會(huì)因外界鹽度變化而發(fā)生相應(yīng)改變［7］，以此適應(yīng)外界水環(huán)境鹽度的變化，在魚(yú)類滲透壓調(diào)節(jié)中起到重要的作用。

金錢(qián)魚(yú)（Scatophagus argus），也稱金鼓魚(yú)，隸屬于鱸形目，廣泛分布于印度-太平洋水域，屬于廣鹽性亞熱帶硬骨魚(yú)類，在滲透調(diào)節(jié)方面具有很強(qiáng)的適應(yīng)性［8］。目前有關(guān)金錢(qián)魚(yú)滲透調(diào)節(jié)方面的研究報(bào)道主要涉及鹽度滲透相關(guān)基因的表達(dá)分析［9-10］、基因的克隆與表達(dá)［11］、抗氧化作用的相關(guān)研究［12］，而鹽度對(duì)金錢(qián)魚(yú)的組織學(xué)研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用普通光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡，觀察金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)在不同鹽度梯度下鰓線粒體豐富細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，比較分析鰓線粒體豐富細(xì)胞在鹽度適應(yīng)過(guò)程中的變化規(guī)律，以期為闡明魚(yú)類鰓的結(jié)構(gòu)特征與其鹽度適應(yīng)調(diào)節(jié)關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所海南瓊海研究中心人工繁殖的金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)，選擇規(guī)格為（4.68±0.09）cm、（6.31±0.25）g的健康幼魚(yú)空運(yùn)至東海水產(chǎn)研究所福建福鼎研究中心，暫養(yǎng)于基地水池中，周期30 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)暫養(yǎng)期間溫度為（22±0.5）℃，pH7.8～8.1，氨氮（0.10±0.02）mg·L-1、溶氧大于6.5 mg·L-1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置鹽度梯度為0、5、10、20、30、35，以當(dāng)?shù)刈匀缓Ｋ}度20）為對(duì)照組，通過(guò)向淡水中加入不同比例的海水晶調(diào)制成鹽度5、10、30、35。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾魚(yú)，飼養(yǎng)于直徑80 cm、高72 cm的塑料水槽中，24 h不間斷充氣，每天換水三分之一，并于早晚各喂食1次，投喂飼料為魚(yú)體質(zhì)量的1%，投喂1 h后吸污。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)30 d后取樣，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)死亡。

1.3 樣品采集

從各水槽內(nèi)隨機(jī)選取3尾幼魚(yú)，于冰盤(pán)上解剖，采集左側(cè)第二鰓弓鰓絲。

光鏡樣品用波恩溶液保存，固定24 h，經(jīng)流水沖洗，在Lecia TP 1020脫水機(jī)下進(jìn)行乙醇梯度脫水（脫水梯度：0%、80%、95%、100%），石蠟包埋，Lecia RM 2135切片機(jī)超薄切片，切片厚度為4～5μm。經(jīng)蘇木精-伊紅染色，中性樹(shù)膠封片后，在Axio Scope·A1型光學(xué)顯微鏡觀察并進(jìn)行顯微拍照。

電鏡樣品用戊二醛試劑固定，4℃下固定一周，0.1 mg·L-1的PBS室溫沖洗3次，1%鋨溶液固定l h，進(jìn)行乙醇梯度脫水（脫水梯度：30%、50%、70%、80%、90%、100%），分離鰓弓中部的鰓絲，Epon812滲透和包埋，ULTRACUTE超薄切片機(jī)切片，采用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染的常規(guī)電鏡切片染色，日立（JSM 5610）透射電鏡觀察、拍照。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量與統(tǒng)計(jì)分析

將光學(xué)顯微鏡拍照所得照片用Imager proplus 6.0軟件校準(zhǔn)后，測(cè)量金錢(qián)魚(yú)不同組別鰓絲上的初級(jí)鰓小片直徑和次級(jí)鰓小片直徑，在相同部位隨機(jī)測(cè)量6組數(shù)據(jù)，然后取平均值。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)（SD±SEM）在SPSS 24軟件上進(jìn)行單因子方差分析（ANOVA），并進(jìn)行Duncan多重比較法檢驗(yàn)組間差異（P＝0.05），將所得結(jié)果用EXCEL 2016制作成表格進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓的顯微結(jié)構(gòu)

在光學(xué)顯微鏡下，線粒體豐富細(xì)胞、粘液細(xì)胞以及扁平上皮細(xì)胞均分布在鰓小片和鰓絲上（圖1），通過(guò)HE染色，每種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)均被伊紅染成淺紅色，細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色。

淡水條件下，線粒體豐富細(xì)胞主要分布在初級(jí)鰓小片基部，細(xì)胞著色較深，初級(jí)鰓小片直徑（57.350±9.114）μm顯著小于對(duì)照組（75.367±8.429）μm（P＜0.05）（表1），次級(jí)鰓小片直徑（8.850±2.057）μm與對(duì)照組（7.817±1.298）μm差異不大。粘液細(xì)胞主要分布在細(xì)胞外軟骨質(zhì)中，血細(xì)胞數(shù)量較少（圖1-a）。

表1 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)鰓小片直徑的變化Tab.1 Changes of gill lamella diameter of juvenile Scatophagus argus under different salinities

鹽度5組線粒體豐富細(xì)胞主要分布在次級(jí)鰓小片基部。初級(jí)鰓小片直徑（71.600±3.543）μm與對(duì)照組（75.367±8.429）μm差異不大，次級(jí)鰓小片直徑（11.750±1.388）μm顯著大于對(duì)照組（7.817±1.298）μm（P＜0.05）（表1），故次級(jí)鰓小片呈膨脹狀態(tài)，膨大光圈（圖1-c）。粘液細(xì)胞數(shù)量明顯增加，軟骨細(xì)胞可見(jiàn)于細(xì)胞外軟骨質(zhì)中，其軟骨質(zhì)間隔較淡水組明顯增大，血細(xì)胞由初級(jí)鰓小片向次級(jí)鰓小片頂端蔓延，細(xì)胞呈圓形（圖1-b）。

圖1 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓的顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Microstructure of gills of juvenile Scatophagus argus under different salinity groups

鹽度10組線粒體豐富細(xì)胞分布于次級(jí)鰓小片上，以及次級(jí)鰓小片基部。初級(jí)鰓小片直徑（92.050±9.408）μm顯著大于對(duì)照組（75.367±8.429）μm（P＜0.05），基部明顯膨大（表1），次級(jí)鰓小片直徑（9.500±1.562）μm與對(duì)照組（7.817±1.298）μm差異不大，粘液細(xì)胞數(shù)量增加，分布廣泛（圖1-d）。

鹽度20組（對(duì)照組）線粒體豐富細(xì)胞主要位于初級(jí)鰓小片上。血細(xì)胞主要位于次級(jí)鰓小片上，排列緊密，少量見(jiàn)于細(xì)胞外軟骨質(zhì)中，粘液細(xì)胞主要分布在初級(jí)鰓小片上（圖1-e）。

鹽度30組線粒體豐富細(xì)胞主要分布在初級(jí)鰓小片上，以及次級(jí)鰓小片基部，初級(jí)鰓小片直徑（61.167±6.364）μm 和次級(jí)鰓小片直徑（6.830±1.405）μm均顯著小于對(duì)照組的初級(jí)鰓小片直徑（75.367±8.429）μm和次級(jí)鰓小片直徑（7.817±1.298）μm（P＜0.05），細(xì)胞著色較深，次級(jí)鰓小片輪廓模糊，邊界處細(xì)胞增生，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多（圖1-f）。

鹽度35組線粒體豐富細(xì)胞主要分布在初級(jí)鰓小片上，數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞著色較深。初級(jí)鰓小片直徑和次級(jí)鰓小片直徑與對(duì)照組差異不大，鰓絲形態(tài)最接近于對(duì)照組。鰓絲細(xì)長(zhǎng)向外圍延伸，血細(xì)胞均勻排列分布在次級(jí)鰓小片上，粘液細(xì)胞數(shù)量較少（圖1-g）。

2.2 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓的超微結(jié)構(gòu)

淡水條件下，線粒體豐富細(xì)胞多為橢圓形，數(shù)量較少，多與支持細(xì)胞相鄰分布，大部分線粒體豐富細(xì)胞無(wú)法直接觀察到細(xì)胞核，胞質(zhì)內(nèi)線粒體密集，具珠泡結(jié)構(gòu)，不具頂端開(kāi)口（圖2-a）。

鹽度5組線粒體豐富細(xì)胞大多為橢圓形，分為不具頂端開(kāi)口和具頂端開(kāi)口兩種形態(tài)，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成頂隱小窩，其中具頂端開(kāi)口的線粒體豐富細(xì)胞具有兩種開(kāi)口模式：1）頂端開(kāi)口較淺，頂端突起程度較小，為突起型（Ⅰ型）；2）頂端開(kāi)口較深，開(kāi)口內(nèi)部具有凸起的頂膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間緊密連接，開(kāi)口處有微脊結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，為凹陷型（Ⅱ型）（圖2-b）。

鹽度10組線粒體豐富細(xì)胞多呈圓形，核基位，胞核形狀規(guī)則呈圓形，且體積較大，細(xì)胞之間緊密連接，兩兩相鄰，相鄰細(xì)胞之間具有較大的孔洞結(jié)構(gòu)，頂端開(kāi)口較小，且頂膜平滑，與鹽度5組有較大差別，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量較多，密度大（圖2-c）。

鹽度20組（對(duì)照組）線粒體豐富細(xì)胞多呈橢圓形，胞核呈橢圓形，核基位，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量較少，密度低，多與其他輔助細(xì)胞相鄰，形成多細(xì)胞復(fù)合體結(jié)構(gòu)，與其他組別不同的是，鹽度20組具有發(fā)達(dá)的柱狀微絨毛結(jié)構(gòu)（圖2-d）。

鹽度30組線粒體豐富細(xì)胞呈溶解狀，胞核呈圓形，核基位，胞質(zhì)內(nèi)線粒體分布零散，具發(fā)達(dá)的微細(xì)小管系統(tǒng)和囊管細(xì)胞，線粒體豐富細(xì)胞具多個(gè)頂端開(kāi)口，且開(kāi)口較大，具有凸起的頂膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞開(kāi)放基本與外界直接接觸，為深洞型（Ⅲ型）（圖2-e）。

鹽度35組線粒體豐富細(xì)胞體積較大，呈扁平狀，胞核呈橢圓形，形態(tài)不規(guī)則，少數(shù)細(xì)胞核出現(xiàn)色素沉積反應(yīng)，細(xì)胞之間緊密連接，具發(fā)達(dá)的管網(wǎng)結(jié)構(gòu)（圖2-f）。

圖2 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓的超微結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Ultrastructure of gills of juvenile Scatophagus argus under different salinity groups

3 討論

硬骨魚(yú)類鰓的主要功能是運(yùn)輸水和離子，當(dāng)外界滲透壓高于體內(nèi)滲透壓時(shí)，一般會(huì)通過(guò)吞飲海水、減少尿量防止水分流失，排出鈉鉀離子（Na＋、K＋）等方式維持滲透平衡；而外界滲透壓低于體內(nèi)滲透壓時(shí)，一般通過(guò)增加尿量，從外界吸收鈉離子（Na＋）、氯離子（Cl-），并且停止飲水等方式適應(yīng)鹽度改變［13-14］。魚(yú)鰓上的線粒體豐富細(xì)胞會(huì)通過(guò)自身形態(tài)結(jié)構(gòu)、各亞基之間結(jié)構(gòu)的可逆性轉(zhuǎn)變，以及細(xì)胞內(nèi)的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化共同維持內(nèi)外環(huán)境的滲透壓平衡，以維持自身的生長(zhǎng)平衡［11］。

3.1 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓的顯微結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，淡水環(huán)境下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)線粒體豐富細(xì)胞初級(jí)鰓小片直徑顯著小于對(duì)照組，鹽度5組次級(jí)鰓小片直徑顯著大于對(duì)照組，且鰓絲部分膨大，鹽度10組初級(jí)鰓小片直徑顯著大于對(duì)照組，說(shuō)明低鹽環(huán)境下，金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓絲較寬，鰓小片寬且長(zhǎng)，有利于鰓與外界水體環(huán)境的充分接觸，通過(guò)吸收水體中的無(wú)機(jī)離子維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，這與中華鱘（Acipenser sinensis）幼魚(yú)鰓［15-16］和紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）幼魚(yú)鰓［17］在低鹽環(huán)境下的顯微觀察結(jié)果一致，也可能是由于代謝水平較低而通過(guò)增加排尿的方式保持鹽 分［18-19］。吳 勇 等［20］研 究 發(fā) 現(xiàn) 細(xì) 鱗 鯻（Terapon jarbua）幼魚(yú)在低鹽脅迫下，出現(xiàn)明顯吸水現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)次級(jí)鰓小片會(huì)出現(xiàn)膨大的光圈結(jié)構(gòu)，大大的增加了與外界水環(huán)境的接觸面積，故為淡水適應(yīng)性結(jié)構(gòu)。

鹽度30、35組次級(jí)鰓小片直徑顯著小于對(duì)照組（鹽度20），但是鰓絲變得細(xì)長(zhǎng)，隨著鹽度的升高，鰓小片寬度逐漸變小，說(shuō)明在高鹽環(huán)境下，金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)通過(guò)縮短次級(jí)鰓小片間距，以及改變鰓絲結(jié)構(gòu)來(lái)排出鹽分和吸收水分，并且線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量也顯著增加［21-23］，馬慧等［24］的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫可能對(duì)魚(yú)類的機(jī)體損傷程度較小，魚(yú)體可以通過(guò)自身的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)適應(yīng)外界的水體鹽度變化，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中高鹽度組的鰓絲形態(tài)與對(duì)照組最為相似。高鹽環(huán)境下，次級(jí)鰓小片變得細(xì)長(zhǎng)，有利于增大與外界的接觸面積，線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量明顯增加，著色較深，說(shuō)明其細(xì)胞內(nèi)的線粒體數(shù)量較多，故為海水適應(yīng)性結(jié)構(gòu)。

3.2 不同鹽度下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓的超微結(jié)構(gòu)

金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓線粒體豐富細(xì)胞隨著鹽度升高，頂膜開(kāi)口凹陷程度增加，出現(xiàn)突起型（Ⅰ型）、凹陷型（Ⅱ型）和深洞型（Ⅲ型），不同于其他研究的是，淡水組和鹽度35組未見(jiàn)明顯頂膜開(kāi)口，可能與FRIDMANS等［25］對(duì)尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）的研究結(jié)果類似，即存在一種Ⅰ型的過(guò)渡類型。趙峰等［26］研究發(fā)現(xiàn)，高鹽條件下的中華鱘幼魚(yú)鰓上皮頂膜開(kāi)口為Ⅲ型的線粒體豐富細(xì)胞代替了低鹽條件下頂膜開(kāi)口為Ⅰ型的線粒體豐富細(xì)胞，利用這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化來(lái)適應(yīng)高滲環(huán)境。故推測(cè)本文中鹽度35組Ⅰ型的過(guò)渡類型線粒體豐富細(xì)胞代替高滲條件下Ⅲ型的線粒體豐富細(xì)胞，以此適應(yīng)高滲環(huán)境。

淡水環(huán)境下金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)鰓線粒體豐富細(xì)胞多呈橢圓形，數(shù)量較少，隨著鹽度升高，細(xì)胞數(shù)量隨之增加且分布越來(lái)越緊密，微嵴結(jié)構(gòu)明顯，鹽度30組線粒體豐富細(xì)胞呈溶解狀態(tài)，出現(xiàn)破裂脫落的現(xiàn)象，細(xì)胞核呈圓形，頂膜開(kāi)口為深洞型（Ⅲ型），頂端小窩周圍可見(jiàn)豐富囊管系統(tǒng)和微細(xì)小管系統(tǒng)，且與頂膜相連，外圍微嵴結(jié)構(gòu)豐富，細(xì)胞開(kāi)放直接與外界水環(huán)境接觸，造成線粒體豐富細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變［27-29］。鹽度上升至30后，Ⅲ型線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量增加，故可推測(cè)Ⅲ型頂膜開(kāi)口為海水型線粒體豐富細(xì)胞主要形態(tài)類型。本研究中頂膜開(kāi)口為Ⅱ型和Ⅲ型線粒體豐富細(xì)胞通過(guò)增加與外界的接觸面，從而吞飲海水，排出Na＋、K＋等離子，為離子排出型線粒體豐富細(xì)胞，頂膜開(kāi)口為Ⅰ型的線粒體豐富細(xì)胞開(kāi)口較小，從而減少水分流失，并且具有吸收鈣離子（Ca2＋）的重要作用，為離子吸收型線粒體豐富細(xì)胞［30-32］。

本研究及之前研究結(jié)果顯示，金錢(qián)魚(yú)幼魚(yú)在不同鹽度條件下具有較強(qiáng)的適應(yīng)性［33］，其在低鹽環(huán)境下線粒體豐富細(xì)胞主要通過(guò)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，分化出具不同頂端開(kāi)口的線粒體豐富細(xì)胞；高鹽環(huán)境下主要通過(guò)線粒體豐富細(xì)胞數(shù)量的增加，以及深洞型（Ⅲ型）的線粒體豐富細(xì)胞適應(yīng)高滲環(huán)境。這種適應(yīng)性結(jié)構(gòu)的改變，有利于金錢(qián)魚(yú)在不同鹽度水體中生存，與金錢(qián)魚(yú)具有較強(qiáng)的鹽度適應(yīng)性密切相關(guān)。