麥冬、大黃飲片電子束輻照滅菌工藝研究

王 鋼 王 丹,* 何 毅 付 孟 唐藝文 青 川 高 鵬 黃 敏

(1 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2 四川省原子能研究院，四川 成都 610101；3 輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101)

麥冬(Ophiopogonjaponicus)、大黃(RheumpalmatumL.)是兩種重要的傳統中藥材，廣泛應用于臨床制劑和保健品領域[1-2]。麥冬水分、糖分含量較高，表皮容易破損黏連；大黃根莖較大，干燥困難。兩種藥材在采收、干燥、炮制加工及貯藏等環節中均易感染微生物，造成變質、腐敗等問題[3]。目前，麥冬、大黃的加工貯藏方式主要是硫磺熏蒸。但硫磺熏蒸易造成二氧化硫殘留超標[4]，降低藥材品質，甚至對人體健康造成危害[5]。因此，亟待研究一種新的藥材加工貯藏方式。

輻照技術作為一種綠色、高效的殺菌技術，能最大限度地保持中藥材的性狀、活性成分含量及藥理活性[6]。60Co-γ射線輻照能顯著降低大黃、麥冬、川芎等中藥材中的細菌和霉菌含量，對藥材的主要活性成分含量和指紋圖譜相似度均無顯著影響[4,7]。近年來，隨著高能電子加速器(10 MeV)的研發和推廣，電子束輻照技術逐漸被發展完善[8]。與γ射線輻照相比，電子束輻照技術具有投入成本低、安全性更強、加工效率高、射線利用率高、不產生核廢物等優點，目前已得到廣泛的推廣應用。2015年發布的《中藥輻照滅菌技術指導原則》，已將高能電子束作為降低藥品微生物含量的滅菌方式之一[9]。

高能電子束輻照技術在我國起步較晚，缺乏輻照生物學效應、輻照加工工藝、質量標準等基礎性研究。目前，電子束輻照在肉品貯藏和果蔬保鮮領域中的應用被廣泛報道[10-12]，但在中藥貯藏養護中的應用研究較少[13]，尤其是用于麥冬和大黃的貯藏養護更是鮮有報道。為此，本研究以麥冬、大黃飲片為試驗材料，探究不同劑量高能電子束輻照對兩種藥材飲片微生物數量、理化指標、指紋圖譜及有效成分含量的影響；探究不同堆碼厚度、不同輻照方式對兩種飲片輻照吸收劑量分布及吸收劑量不均勻度的影響，旨在探明適宜麥冬、大黃飲片的輻照滅菌工藝，為麥冬、大黃加工貯藏以及電子束輻照在中藥材中的應用提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥冬、大黃飲片購自四川省中興藥業有限公司，經西南科技大學侯大斌教授鑒定為麥冬(Ophiopogonjaponicus)的干燥塊根、掌葉大黃(RheumpalmatumL.)的干燥根莖。

甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品(純度均≥ 98%)，成都埃法生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸為分析純，成都市科隆化學品有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；重鉻酸銀劑量計，四川省原子能研究院自制，校準標準參照《JJG 1028-1991使用重鉻酸銀劑量計測量γ射線水吸收劑量標準方法》[14]。

1.2 儀器與設備

5804R高速離心機，德國Eppendorf公司；RHCX-350超聲清洗器，濟寧榮匯超聲波設備有限公司；HH-W600數顯三用恒溫水箱，金壇市醫療儀器廠；GH6000型隔水培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；IS1020高能電子加速器，同方威視科技(北京)有限公司；GE60DA高壓蒸汽滅菌鍋，美國致微公司；UltiMate3000DGLC雙三元、二維液相色譜儀系統，美國賽默飛世爾公司；SI-234電子天平，丹佛儀器(北京)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻照處理 在重慶恒德輻照有限公司進行電子束輻照，電子加速器功率為20 kW，電子束能量為10 MeV，劑量率設定為260 Gy·s-1。麥冬、大黃飲片輻照劑量設定為2、4、6、8 kGy，以未輻照樣品為對照，重鉻酸銀劑量計測得樣品的實際吸收劑量分別為1.959、4.167、6.114、7.824 kGy。所有樣品均設置3個重復。

1.3.2 微生物檢驗 麥冬飲片需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數按《中華人民共和國藥典》2020版[15]檢測。大黃飲片需氧菌總數采用培養基稀釋法測定，霉菌和酵母菌計數按平板涂布法檢測[16]。需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數含量檢測結果以log(CFU·g-1)表示。

1.3.3 理化指標測定 將麥冬、大黃飲片粉碎過24目篩，混勻。按《中華人民共和國藥典》2020版[10]測定麥冬、大黃的水分、總灰分及水溶性浸出物含量。

1.3.4 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)指紋圖譜測定

1.3.4.1 色譜條件 Hyersil GOLD(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL· min-1； 麥冬檢測波長296 nm[17]，麥冬以乙腈-水 (65∶35,v/v) 為流動相；大黃檢測波長254 nm，大黃以甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15,v/v)為流動相[10]。

1.3.4.2 對照品溶液制備 精密稱取9.08 mg甲基麥冬黃烷酮A和10.2 mg甲基麥冬黃烷酮B對照品，分別加甲醇超聲溶解并定容至25 mL，制成質量濃度分別為0.339 2、0.400 8 mg·mL-1的對照品供試液，用于麥冬指紋圖譜測定；精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16 μg，含大黃素甲醚8 μg的對照品供試液，用于大黃飲片指紋圖譜測定[10]。

1.3.4.3 供試品溶液制備 取麥冬粉末(過65目篩)3 g，加入30 mL甲醇超聲提取30 min，于 10 414 r·min-1離心15 min[18]，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液即為麥冬供試品溶液；取大黃粉末(過65目篩) 約0.1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 75%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，用75%甲醇補足減失質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，濾液即為大黃供試品溶液。

1.3.5 有效成分含量測定

1.3.5.1 線性關系的考察 精密稱取1.3.4.2中的對照品溶液分別稀釋制成濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的溶液，計算回歸方程。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，各組分質量濃度(X, μg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

1.3.5.2 定量分析 按《中華人民共和國藥典》2020版中通則0521高效液相色譜法中的外標法[15]計算麥冬、大黃飲片有效成分含量。

1.3.6 輻照加工工藝 麥冬飲片采用聚酯真空袋包裝，產品密度0.38 g·cm-1；大黃飲片壓碎裝袋，產品密度0.21 g·cm-1，每袋厚度2 cm。每袋上下分別放置一對重鉻酸銀劑量計，跟蹤實際吸收劑量。麥冬、大黃飲片分別采用單雙面輻照工藝，劑量設置為4 kGy，具體工藝見圖1。通過測定麥冬、大黃飲片在輻照加工過程中不同厚度的最大吸收劑量(Dmax)和最小吸收劑量(Dmin)，計算對應的劑量不均勻度(U)=Dmax/Dmin，以U<1.2 為加工標準，確定麥冬、大黃飲片最適宜輻照加工工藝。

圖1 麥冬、大黃飲片輻照工藝Fig.1 Irradiation process of decoction pieces of Ophiopogon japonicus and Rheum palmatum L.

2 結果與分析

2.1 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片中微生物存活數的影響

試驗設定了5個輻照劑量組，輻照滅菌效果見圖2。麥冬飲片的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數原始含菌量分別為5.57、3.53 log(CFU·g-1)；大黃飲片的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數原始含菌量分別為6.08、5.38 log(CFU·g-1)。 麥冬飲片經2 kGy劑量輻照后，微生物數量下降至檢測限以下[<1.0 log(CFU·g-1)]；大黃飲片經2 kGy劑量輻照后，需氧菌總數減少了63%，霉菌和酵母菌總數減少了65%，經4 kGy劑量輻照后，微生物含量均下降至檢測限以下。根據《中國藥典》2020版[15]，直接口服及泡服飲片需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數限度分別為5、3 log(CFU·g-1)的規定，麥冬飲片輻照滅菌劑量為2 kGy時、大黃飲片輻照滅菌劑量為4 kGy時，微生物數量能達到限度標準。

圖2 麥冬、大黃飲片輻照滅菌效果Fig.2 Irradiation sterilization effect of decoction pieces of Ophiopogon japonicus and Rheum palmatum L.

2.2 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片理化指標的影響

麥冬、大黃飲片經0、2、4、6 和8 kGy 5種不同輻照劑量處理后，其理化指標結果見表1和2。由表1可知，輻照處理對麥冬飲片的理化性質水分、總灰分、水溶性浸出物含量均無顯著影響(P>0.05)。由表2可知，輻照處理對大黃飲片的干燥失重和總灰分含量均無顯著影響(P>0.05)，0～6 kGy時，水溶性浸出物含量隨輻照劑量的增加而顯著增加，且增幅大體上與輻照劑量呈正相關。

表1 不同劑量輻照處理對麥冬飲片水分、水溶性浸出物、總灰分的影響Table 1 Effects of different doses of irradiation on water, water-soluble extract and total ash of decoction pieces of Ophiopogon japonicus

2.3 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片指紋圖譜變化的影響

甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B對照品指紋圖譜如圖3所示。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品指紋圖譜如圖4所示。在麥冬飲片指紋圖譜上共選擇標定了11個共有特征峰，通過與對照品比對，可確認8號峰為甲基麥冬黃烷酮A，9號峰為甲基麥冬黃烷酮B；在大黃飲片指紋圖譜上共標定了7個共有特征峰，通過與對照品比對，可確認1、3、5、6和7號峰分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0軟件分別對不同劑量電子束輻照麥冬、大黃飲片指紋圖譜進行多點位校正、自動匹配，用中位數法生成對照圖譜R，即共有模式圖(圖5、圖6)，并計算相似度(表3、表4)。分別以甲基麥冬黃烷酮A、大黃素為參比峰，計算麥冬飲片、大黃飲片特征峰的相對保留時間(表5、表6)。依據表中結果可知，5個輻照劑量下麥冬、大黃飲片特征峰相似度均達到0.99，相對保留時間的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)均小于0.5%，說明在2～8 kGy的輻照劑量不會對麥冬、大黃飲片的化學成分一致性產生影響。

表2 不同劑量輻照處理對大黃飲片干燥失重、水溶性浸出物、總灰分的影響Table 2 Effects of different doses of irradiation on drying loss, water-soluble extract and total ash of decoction pieces of Rheum palmatum L.

表3 不同劑量輻照處理對麥冬飲片相似度評價結果的影響Table 3 Effects of different doses of irradiation on similarity evaluation results of decoction pieces of Ophiopogon japonicus

表4 不同劑量輻照處理對大黃飲片相似度評價結果的影響Table 4 Effects of different doses of irradiation on similarity evaluation results of decoction pieces of Rheum palmatum L.

表5 不同劑量輻照處理對麥冬飲片指紋圖譜相對保留時間的影響Table 5 Effects of different doses of irradiation on relative retention time of fingerprint of decoction pieces of Ophiopogon japonicus

表6 不同劑量輻照處理對大黃飲片指紋圖譜相對保留時間的影響Table 6 Effects of different doses of irradiation on relative retention time of fingerprint of decoction pieces of Rheum palmatum L.

注：8: 甲基麥冬黃烷酮A; 9: 甲基麥冬黃烷酮B。Note: 8: Methylophiopogonanone A. 9: Methylophiopogonanone B.圖3 麥冬飲片混合對照品 HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference substance of decoction pieces of Ophiopogon japonicus

注：1: 蘆薈大黃素; 3: 大黃酸; 5: 大黃素; 6: 大黃酚; 7: 大黃素甲醚。Note: 1: Aloe-emodin. 3: Rhein. 5: Emodin. 6: Chrysophanol. 7: Physcion.圖4 大黃飲片混合對照品 HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of mixed reference substance of decoction pieces of Rheum palmatum L.

2.4 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片有效成分含量變化的影響

7種化合物的線性關系結果見表7，線性關系良好。不同劑量輻照后的麥冬飲片中的甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮 B含量測定結果見表8，大黃飲片中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量測定結果見表9。各劑量下的有效成分含量無顯著差異(P>0.05)，表明5種劑量輻照處理后的麥冬飲片、大黃飲片有效成分含量無顯著變化，即無分解及降解損失。故在2～8 kGy劑量輻照下對麥冬、大黃飲片中的有效成分含量均無影響，在此輻照劑量范圍內輻照的兩種藥材飲片與未輻照處理的樣品相比具有質量均一。

2.5 不同輻照工藝對麥冬、大黃飲片輻照劑量分布及劑量不均勻度的影響

在輻照加工中，測量產品中劑量分布的主要目的是為了確定最大吸收劑量Dmax和最小吸收劑量Dmin的位置和量值以及輻照劑量不均勻度(U)[19]。根據劑量跟蹤測量結果，吸收劑量分布結果見表10。單面輻照條件下，麥冬飲片厚度為4 cm時，U=1.13，Dmin=3.81 kGy，高于最低有效劑量2 kGy；大黃飲片厚度為6 cm時，U=1.13，Dmin=4.35 kGy，高于最低有效劑量4 kGy，均符合加工標準。隨輻照厚度增加，劑量不均勻度(U)增加，超出一定厚度時，Dmin小于最低有效劑量。雙面輻照條件下，麥冬飲片厚度為10 cm時，U=1.18，Dmin=4.48；大黃飲片厚度為14 cm時，U=1.19，Dmin=5.95。不同厚度間的劑量不均勻度大致相等，且Dmin均高于最低有效劑量、Dmax均低于最高耐受劑量8 kGy。

注：R: 對照圖譜; S1: 未輻照; S2: 2 kGy輻照劑量; S3: 4 kGy輻照劑量; S4: 6 kGy輻照劑量; S5: 8 kGy輻照劑量。下同。Note: R: Control mapping. S1: Unirradiated. S2: 2 kGy irradiation dose. S3: 4 kGy irradiation dose. S4: 6 kGy irradiation dose. S5: 8 kGy irradiation dose. The same as following.圖5 不同劑量輻照處理麥冬飲片指紋圖譜的共有特征峰與共有模式圖Fig.5 common characteristic peaks and common patterns of fingerprint of decoction pieces of Ophiopogon japonicus treated with different doses of irradiation

圖6 不同劑量輻照處理大黃飲片指紋圖譜的共有特征峰與共有模式圖Fig.6 Common characteristic peaks and common patterns of fingerprints of decoction pieces of Rheum palmatum L. treated with different doses of irradiation

3 討論

3.1 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片中微生物存活數的影響

中藥材由于采收及炮制加工條件粗放，極易感染環境中的微生物，在貯藏過程中出現霉變現象。電離輻射可破壞微生物中的DNA雙鏈、酶、以及蛋白質，從而殺死藥材中的微生物[20-23]。本研究結果表明，高能電子束輻照能顯著降低麥冬、大黃飲片中微生物含量。2 kGy輻照劑量可使麥冬飲片基本達到無菌水平。然而，2 kGy劑量輻照大黃飲片后，仍能檢測出約4個對數級別的需氧菌、霉菌和酵母菌總數，4 kGy輻照才使得大黃飲片微生物數量降至檢測限以下，與麥冬飲片存在差異。其原因可能是藥材的初始微生物負載越高，適宜的殺菌劑量越大。符國棟[24]用4.5 kGy電子束輻照處理山銀花藥材，使得微生物數量降至檢測限以下。蔡汶莉[25]用電子束輻照百合和山銀花藥材，結果表明兩種藥材的D10值不同。Khawory等[26]研究也表明，爪葉洋茱萸、灌狀買麻藤、非洲楝的適宜輻照劑量為9 ～ 13 kGy，而其葉提取物的適宜輻照劑量為6 ～ 12 kGy。

表7 7種化合物線性回歸方程Table 7 Linear regression equation of 7 compounds

表8 不同劑量輻照處理對麥冬飲片有效成分的影響Table 8 Effects of different doses of irradiation on active components of decoction pieces of Ophiopogon japonicus /(μg·g-1)

表9 不同劑量輻照處理對大黃飲片有效成分的影響Table 9 Effects of different doses of irradiation on active components of decoction pieces of Rheum palmatum L. /(μg·g-1)

表10 麥冬、大黃飲片輻照吸收劑量分布Table 10 Irradiation absorbed dose distribution of decoction pieces of Ophiopogon japonicus and Rheum palmatum L.

3.2 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片理化指標的影響

水分含量是影響中藥材貯藏效果的重要因素，水分含量過高或過低都不利于中藥材貯藏[27]。高能電子束輻照是一種“冷加工”技術，因此對中藥飲片理化指標影響較小。韓振明等[28]研究表明輻照對蜈蚣藥粉的水分、總灰分等指標的變化無顯著影響。水溶性浸出物也是藥材質量控制的重要指標，《中華人民共和國藥典》2020版規定大黃水溶性浸出物不得少于25%[15]。本研究表明電子束輻照處理后，大黃水溶性浸出物顯著增加。蔡汶莉[25]報道了電子束輻照后，百合藥材水溶性浸出物含量顯著增加，這與本研究結果一致。水溶性浸出物含量增加的原因可能是蛋白質、鹽類等大分子在輻照后發生降解，產生了糖類化合物、有機酸、游離氨基酸等。

3.3 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片指紋圖譜變化的影響

中藥的質量控制一直是個重難點，而中藥指紋圖譜技術被認為是控制中藥品種和質量的最直接、最準確、最有效的手段[29]。近年來利用指紋圖譜技術評價60Co-γ輻照滅菌對中藥飲片質量的影響已有報道[30-31]，但利用指紋圖譜技術分析電子束輻照對麥冬、大黃飲片的影響報道較少。本研究采用HPLC指紋圖譜技術考察不同電子束輻照劑量對麥冬、大黃飲片指紋圖譜的影響，結果顯示，經輻照處理后的麥冬、大黃飲片的指紋圖譜與未輻照品對比無明顯差異，整體穩定性較好。張夢晨等[30]研究發現經過4、6、8、10 kGy劑量輻照后，山藥飲片的指紋圖譜與未輻照品對比無顯著差異。丁偉等[32]研究發現，60Co-γ 輻照滅菌劑量不超過6 kGy時，對虎杖藥材指紋圖譜無顯著影響。由以上研究可知，適宜的輻照劑量對部分中藥及飲片的整體質量不會產生影響。

3.4 不同劑量輻照處理對麥冬、大黃飲片有效成分含量變化的影響

高能電子束輻照殺菌的同時，射線的直接作用和誘導產生的自由基也可能會對中藥材內部成分產生影響，進而引起有效成分的變化。因此，輻照后飲片有效成分含量的變化也是中藥材輻照加工研究中的重要內容。本研究依據《中藥輻照滅菌技術指導原則》總體平均輻照劑量不高于10 kGy的原則[9]，將最高輻照劑量設置為8 kGy，結果發現在此劑量下未對兩種飲片的有效成分含量產生影響。同時，Khattak等[33]研究表明，60Co-γ射線輻照對紫花苜蓿(Nigellastaiva)種子的總酚含量無顯著影響，經10 kGy以下劑量輻照處理后，水提物中總酚含量無明顯影響，但在12 kGy及以上劑量輻照處理后，酚類物質含量均有所下降，與本研究結果相似。

3.5 不同輻照工藝對麥冬、大黃飲片輻照劑量不均勻度的影響

在輻照過程中，必須了解最大吸收劑量(Dmax)和最小吸收劑量(Dmin)在堆碼產品中的位置與大小[34]。且劑量不均勻度(U)控制在2以內才可用于大規模輻照加工[35]。為保證在實際大批量生產應用過程中，藥材飲片能達到最低有效滅菌劑量，將本研究劑量不均勻度(U)標準設置為1.2。結果表明，單面輻照時，麥冬、大黃飲片吸收劑量均隨輻照深度的增加呈先上升后下降趨勢，其最大吸收劑量(Dmax)均在中部。原因可能是電子束照射到藥材表面后發生電子累積[36]。麥冬飲片堆碼厚度為4 cm，大黃飲片堆碼厚度為6 cm時，劑量不均勻度(U)均在1.20以內，超過該厚度時其劑量不均勻度(U)開始急速增加。雙面輻照可通過劑量疊加，增加其穿透厚度。實際應用加工中多以雙面輻照為主，以降低劑量不均勻度(U)。采用雙面輻照，麥冬飲片堆碼厚度為10 cm時，大黃飲片堆碼厚度約14 cm時，劑量不均勻度(U)可控制在1.20以內，符合產品生產要求。同時，王海宏等[37]對采用電子束輻照速凍蘆筍，結果表明雙面輻照，輻照深度為14.2 cm時，不均勻度1.15，可以滿足生產要求，與本研究結果相似。

4 結論

本研究結果表明，電子束輻照技術適用于麥冬、大黃飲片的貯藏養護。麥冬飲片適宜滅菌劑量可控制在2～8 kGy；大黃飲片可控制在4～8 kGy。單面輻照時，麥冬飲片適宜堆碼厚度為4 cm、大黃飲片為4 ～6 cm；雙面輻照時，麥冬飲片適宜堆碼厚度為10 cm，大黃飲片為14 cm。