非小細胞肺癌組織FGFR3表達與臨床病理及預后的關系

龍惠東 林云恩 譚小軍 江麗雯

根據2020年全球癌癥負擔報告，2020年中國癌癥死亡人數超過300萬，其中肺癌高達71萬，占我國癌癥死亡總數的23.8%。而對于肺癌，靶向治療是非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)的重要的治療手段之一，例如，驅動基因表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的突變，給這部分患者帶來了新的曙光，但是靶向治療目前面臨多重挑戰，如耐藥導致疾病進展、單藥獲益較少等。尋找更多潛在的靶點成為治療的重點。編碼成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)是FGFR家族的一員，調控著許多重要的細胞過程，包括生長、分化和遷移[1-2]。研究表明，FGFR3的表達與膀胱癌、宮頸癌和膠質母細胞瘤等疾病密切相關[3]。然而，FGFR3表達與NSCLC的關系卻鮮有報道。本研究旨在觀察FGFR3在NSCLC中的表達，探討其與NSCLC發生、發展及臨床病理特征和預后的關系。

資料與方法

一、材料與方法

1.標本來源：收集2010年6月至2014年6月經廣州醫科大學附屬腫瘤醫院病理科存檔的NSCLC石蠟包埋蠟塊，86例已手術NSCLC組織(Ⅰ～ⅢA期)，15例配對的癌旁組織作為對照組。經由廣州醫科大學附屬腫瘤醫院研究倫理委員會批準的，批準號：(2019)倫審第(50)號。86例NSCLC患者，男性57例(66.3%)、女性29例(33.7%)，平均年齡58.8歲。臨床病理特征：年齡、性別、吸煙狀態、淋巴結轉移、腫瘤大小、病理分類等。非小細胞肺癌的診斷標準以最新的指南為基礎[4]。腫瘤分期基于第7版國際抗癌聯盟/國際肺癌研究學會(International Union Against Cancer/International Society for the Study of lung cancer, UICC/IASLC)的TNM(Tumor-node-metastasis)分類系統[5]。

2.試劑與設備：兔抗FGFR3購自sigma公司，SP免疫組化染色試劑盒購自北京中山金橋生物有限公司，按說明書操作。

3.組織芯片的制作：收集NSCLC患者的組織切片進行形態學觀察。選取腫瘤組織和及癌旁正常組織的代表性組織區域，在支架上用x軸和y軸標度標記組織陣列進行取樣。35 mm×25 mm×5 mm大小的受體蠟塊，受體蠟塊上打孔，孔的間距為0.9 mm，直徑1.0 mm，孔深約為3～4 mm。采用組織芯片儀(廣州浩瀚儀器有限公司)對相應部位的供蠟進行取樣。然后，將組織芯片獲得的微小柱狀組織植入制備的蠟塊上的陣列孔中。

4.免疫組織化學染色及EGFR突變分析參照說明書執行

5.結果判定標準：評價標準是按著色強弱分為4級：不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按公式H-SCORE=∑Pi(i+1)(I=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例)計算細胞H-SCORE得分[6]。

二、統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行處理，采用兩個獨立樣本t檢驗比較各組間的陽性率和表達強度，采用Cross-table分析在NSCLC組織中表達與臨床病理特征的關系，P<0.05為差異有統計學意義。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線和Cox回歸分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、FGFR3在NSCLC組織中的表達

免疫組化結果顯示，FGFR3在26/86(30.2%)NSCLC組織中高表達，而在15例癌旁組織中均未表達，腺癌22例(22/26，84.6%)，鱗癌4例(4/26，15.4%)，無大細胞肺癌。FGFR3蛋白表達于腫瘤細胞和支氣管上皮細胞胞漿。兩個獨立樣本t檢驗分析顯示，肺癌組織中FGFR3蛋白的表達水平明顯高于癌旁組織(t=-8.376，P<0.001)(見圖1)。

圖1 FGFR3蛋白在NSCLC及癌旁組織的表達(10×20)

二、FGFR3蛋白表達與臨床病理特征的關系

如表1所示：在86例病例中，FGFR3高表達與吸煙史、組織學類型、T分期和EGFR突變呈顯著相關性(P<0.05)。FGFR3高表達與年齡、N分期之間無顯著相關性(P>0.05)。

表1 FGFR3蛋白表達水平與非小細胞肺癌臨床病理特征之間的關系

三、FGFR3表達與NSCLC的生存率相關性

通過Kaplan-Meier生存率分析檢查NSCLC 中FGFR3表達和OS之間的關系。FGFR3高表達相對于FGFR3低表達的患者，其OS顯著提高(Log-rank=5.772，P=0.016)，無病生存期DFS顯著延長(Log-rank=4.239，P=0.040)(見圖2A、B)。

圖2 A：與FGFR3低表達比較，FGFR3高表達OS顯著提高(Log-rank=5.772，P=0.016)；B：與FGFR3低表達比較，FGFR3高表達無病生存期DFS顯著延長(Log-rank=4.239，P=0.040)

四、單變量分析

對非小細胞肺癌患者的預后進行單因素分析，結果可見：年齡、吸煙、組織學類型、T分期、N分期、EGFR突變，為非小細胞肺癌患者預后的非影響因素，然后基于單變量分析結果對選定的變量，性別[(Malevs.Female)，HR(95%CI)：2.501(0.950～6.582)，P=0.063]和FGFR3[(Lowvs.High)HR(95%CI)：0.294(0.102～0.850)，P=0.024](見表2)。

表2 非小細胞肺癌臨床病理特征與預后的單因素的分析

討 論

FGF與FGFR普遍存在于正常細胞中，共同構成FGF信號通路，在細胞生長、分化、遷移、血管生成以及組織創傷修復中起重要作用。目前已鑒定出至少22種哺乳動物FGFR配體(FGFs)，它們大多含有高度同源的序列，參與配體與受體的相互作用。FGFs細胞膜上主要有兩種受體。一種是低親和力受體，即硫酸肝素蛋白多糖(heparin sulfate proteo-glycan, HSPG)。細胞外FGFs通過與HSPG結合幫助FGFRs二聚化、自身磷酸化和激活細胞內通路，同時避免降解。另一類是高親和力受體，即FGFR，屬于跨膜酪氨酸激酶受體家族(transmembrane receptor tyrosine kinase, RTK)。發現了4種FGFRs(FGFR1-4)，它們都是單次跨膜的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)受體，包括胞外區、跨膜區和胞內區。胞外區包含3個免疫球蛋白樣結構域(Ig-I，Ig-II，和Ig-III)。Ig-I主要決定配體結合的親和力；Ig-II是FGF的結合位點；IIg-III在配體結合的選擇性中起關鍵作用。FGFR1-3中，Ig-III的選擇性剪接，生成多種不同配體結合選擇性的亞型；其中，FGFR IIIb和IIIc分別為上皮和間質亞型[7]。不同的FGFs其優勢結合位點不同[3]。

FGFR3是在其他癌種[8]中突變頻率最高的基因之一，也是一個很有前途的靶點。雖然FGFR3突變是腫瘤激活的一種機制，但FGFR3的過度表達發生在多種癌癥，包括肝細胞癌、口腔癌和膀胱癌[9-11]，表明FGFR3在人類癌癥的發生發展中起著重要作用，可能是另一種激活FGFR3的機制。然而，FGFR3在NSCLC中的表達卻鮮為人知。

本研究針對86例已手術NSCLC患者，納入了吸煙史、組織學類型、T分期、N分期、EGFR突變等7 個臨床病理因素，組織芯片和免疫組化結果顯示：FGFR3在86例NSCLC組織和15例癌旁組織中高表達。FGFR3染色陽性率為30.2%(26/86)。腺癌22例(22/26，84.6%)，鱗癌4例(4/26，15.4%)，無大細胞肺癌。提示其在NSCLC的發生發展中可能起重要作用。研究顯示[11]：FGFR3的過表達(28%，n=279)比FGFR3的突變(11%，n=107)更普遍。201/893(22%)的FGFR3野生型腫瘤顯示FGFR3過表達。這個特殊的亞組可能代表了一個相對較大的非突變腫瘤組，其中FGFR3信號有助于轉化的表型[12]，并表明可能從抗FGFR3治療中受益的患者比例更大。我們的研究顯示：與FGFR3低表達組相比，FGFR3高表達組與吸煙史、組織學類型、T分期及EGFR突變顯著相關(P<0.05)；與年齡、N分期等臨床指標無顯著相關性(P>0.05)；這些結果表明FGFR3的表達與腫瘤的發生發展有關。該研究為回顧性研究，該研究是參照第7版TNM進行分期分類，目前NSCLC的分期已經更新至第8版，這種分期分類不同可能會影響患者管理，因為許多臨床醫生基于分期來制定管理策略，故該研究的分期系統可能影響預后結果的判斷，并且對治療計劃存在一定的影響。Kaplan-Meier生存率分析顯示：FGFR3高表達相對于FGFR3低表達的患者，其OS顯著提高，無病生存期DFS顯著延長。可能由于FGFR3在肺腺癌中的表達高于肺鱗癌，且FGFR3高表達組的EGFR突變率較高，后續能有機會接受EGFR-TKI治療，故推測FGFR3高表達患者有較長OS和DFS，與較高EGFR突變密切相關。本研究病理參數對非小細胞肺癌患者的預后的單因素，結果顯示：年齡、吸煙、組織學類型、T分期、N分期和EGFR突變為早中期非小細胞肺癌患者預后的非影響因素，FGFR3可能是OS預后好的獨立預后因子，可以幫助臨床上進一步完善危險度分層以指導治療，后續需進一步功能驗證。