全細胞膜片鉗技術在遺傳性長QT 綜合征和不明原因猝死中的研究進展

舒俊杰 ，陳紅羽 ，劉 凱 ，雷普平

（1）昆明醫科大學司法鑒定中心，云南 昆明 650500;2）信陽市中心醫院醫學影像科，河南 信陽 464000;3）河南圣德司法鑒定中心，河南 信陽 464000;4）昆明醫科大學法醫學院，云南 昆明 650500）

由基因突變引起的心臟離子通道疾?。–ardiac channelopathy）被認為是引起不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD）的首要原因之一，以QT間期延長為主要特征的長QT 綜合征（long QT syndrome，LQTS）是常見的易引起心率失常和心源性猝死的心臟離子通道疾病之一[1]。得益于基因分型技術的發展，研究人員[2]在LQTS 患者以及各型SUD 猝死者DNA 中發現了大量心肌細胞Na+、K+、Ca2+離子通道編碼基因的突變，而明確此類突變的致病性變得尤為重要。全細胞膜片鉗技術（Patch clamp techniques）作為先進的細胞電生理技術，在研究離子通道疾病中的應用日益廣泛，尤其是對于LQTS 相關基因突變致病性的評估、SUD 的預防和死亡原因鑒定等方面具有重要意義。本文對全細胞膜片鉗技術在LQTS 和SUD 中的應用進行綜述。

1 長QT 綜合征的研究現狀

長QT 綜合征是一組以體表心電圖QT 間期延長為主要特征、易引發尖端扭轉型室性心動過速等心律失常、嚴重者可導致猝死的心臟離子通道疾病。研究表明[2]，遺傳性LQTS 是由KCNQ1、KCNH2、SCN5A等編碼心臟Na+、K+、Ca2+等離子通道和（或）相關蛋白基因的突變引起。臨床醫生在排除外源性因素作用后，根據個體體表心電圖QT 間期時長（QTc≥480 ms 或在不明原因暈厥時QTc≥460 ms）并綜合評估患者家族史以及多重心電圖檢測結果進行LQTS 的診斷[3-4]。據報道，LQTS 的發病率約為1∶7 000～1∶2 000，而作為最常見的離子通道疾病之一，LQTS 約占所有SUD 病例的20%～25%，同時LQTS 也是引起兒童和青少年SUD 的主要原因之一[5]。

目前的研究結果已經明確了17 種遺傳性LQTS 亞型的致病基因，各致病基因對應的LQTS亞型、影響（離子）電流和主要致病機制，見表1。其中KCNQ1基因和KNCH2基因均編碼電壓門控K+通道蛋白的α 亞基，二者對應的離子通道分別介導心臟復極化過程中延遲整流鉀電流中的慢速電流（IKS）和快速電流（IKr），KCNQ1和KNCH2基因的功能缺失型突變分別通過減少IKS、IKr，延長心臟復極過程導致LQTS1 和LQTS2；SCN5A基因編碼電壓門控Na+通道蛋白的α 亞基，該離子通道介導心肌細胞復極過程中的晚期內向Nav1.5 電流，SCN5A基因的功能獲得型突變通過增加Nav1.5 電流時程，延長心臟復極過程導致LQTS3。據統計，LQTS1、LQTS2 和LQTS3 作為最常見的3 種LQTS 亞型，占所有基因型陽性患者的比例分別為35%、30%和10%[6]，見表1。

表1 長QT 綜合征各亞型相關的致病基因和致病機制Tab.1 Pathogenic genes and mechanism of different LQTS subtypes

2 長QT 綜合征與不明原因猝死

SUD 是指經法醫學尸體解剖、組織病理學檢驗及其他科學手段全面檢驗后仍無法明確死因的猝死，現場勘查或案情調查也未發現與死亡有關的證據，這使得SUD 成為法醫病理學的工作難點和研究熱點之一。

新近研究顯示基因突變導致的離子通道疾病已經成為SUD 的罪魁禍首，學者Ackerman[7]在1999 年首次通過基因測序技術對一名在游泳時發生SUD 的19 歲健康女性進行了4 個LQTS 致病基因（KCNQ1、HERG、KCNE1、SCN5A）的分子遺傳學篩查，發現該女性KCNQ1基因第1 外顯子區存在373-381（GCCGCGCCC）的堿基缺失，明確其生前患有致死性的長QT 綜合征。

此后，基于基因檢測技術的發展和應用，法醫工作者對大量SUD 案例中猝死者的石蠟包埋組織、凍存組織和LQTS 確診患者的血液樣本進行的基因檢測發現，大量LQTS 致病基因突變（包含錯義突變、移碼突變和插入/缺失突變等）可能是導致各型SUD 的遺傳危險因子。例如，2013 年Liu Chao 等[8]對120 名散發性不明原因夜間猝死綜合征（SUNDS）猝死者血液DNA 的KCNQ1、KCNH2、KCNE1、KCNE2外顯子、外顯子-內含子交界區進行了死后遺傳分析顯示，14 個罕見基因突變（MAF ＜ 0.01，包含KCNE1基因1 個、KCNE22 個、KCNH25 個、KCNQ16 個）和14 個單核苷酸多態性（MAF ＞ 0.01，包含KCNE12 個、KCNH25 個、KCNQ17 個）與中國南部SUNDS 的發生有關。另外，2018 年Jia Penglin 等[9]對83例散發性和3 例家庭聚集性云南不明原因猝死（YNSUD）死者的石蠟包埋心肌組織DNA 進行4 個已知LQTS 致病基因突變熱點區（KCNQ1第3 外顯子、KCNH2第6、7 外顯子和SCN5A第28 外顯子）基因測序后，結合生物信息學軟件PolyPhen-2 進行蛋白質功能預測發現，KCNQ1基因R192L突變致病和KCNH2基因Y597N 致病突變（PolyPhen-2 預測分值 ＞ 0.98）可能與YNSUD 的發生有關。

值得注意的是，既往對SUD 死者和LQTS 確診患者進行的基因篩查中發現了大量的相關“致病基因突變”，學者們通常依據基于不同原理的生物信息學軟件對所檢測到的基因突變（堿基/氨基酸替換）進行致病性評估。目前常用的預測軟件有SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster、PROVEAN、Mutation Assessor 等，這些軟件主要對基因突變位點的氨基酸特性或突變位點及鄰近區域的序列保守性等特征進行分析，給出不同預測結果（良性、有害或致病等），例如SIFT 通過進化保守性和位置特異性評分矩陣進行預測；PolyPhen-2 基于進化保守性與蛋白質的三維結構并利用貝葉斯分類器計算后驗概率來預測突變的致病性；PROVEAN是依據進化保守性、神經網絡模型、BLOSUM62氨基酸替換打分矩陣預測[10-11]，由于不同軟件遵循不同原理，所以不同軟件對同一突變致病性的預測結果可能有所不同，甚至相差很大，這就導致在缺乏功能驗證的情況下只依據生物信息學軟件預測結果判定基因突變的致病性，可能無法在攜帶基因突變的猝死者親屬和LQTS 患者中準確篩查出猝死高危人群，故有必要結合生物信息學軟件預測結果對LQTS 相關基因突變進行功能驗證試驗。

3 全細胞膜片鉗技術在LQTS 基因突變致病性驗證中的應用

20 世紀70 年代，德國學者Neher 和Sakmann[12]為了記錄乙酰膽堿刺激青蛙肌細胞膜產生的離子電流而創建了膜片鉗技術（Patch-clamp techniques），它是通過阻抗微電極與細胞膜之間形成緊密接觸、采用電壓鉗或電流鉗記錄生物膜上一種或多種離子通道的電活動，來研究其門控特性、藥理學特性、生理功能以及結構與功能關系等問題的微電極技術。全細胞膜片鉗技術作為膜片鉗的記錄模式之一，可以獲得細胞膜上部分或所有離子通道的綜合特性，揭示細胞的電生理狀態，目前已被學者廣泛應用LQTS 致病基因突變在細胞水平的功能驗證[13-15]。

目前驗證LQTS 致病基因突變功能的方法需聯合應用基因克隆、基因編輯等分子生物學技術。對于心臟離子通道疾病而言，可構建穩定或瞬時表達人源LQTS 致病基因突變的細胞系，或者構建轉基因動物分離心肌細胞/起搏細胞，再利用全細胞膜片鉗來檢測突變基因編碼Na+、K+、Ca2+離子通道的功能變化。在全細胞膜片鉗技術操作中，使用微電極接觸浸潤于細胞外液中的細胞，給予負壓吸破細胞膜形成緊密密封，使細胞內液與電極內液接通，此方法檢測結果穩定且對細胞損傷小，已經成為離子通道疾病研究中最重要的技術[15]。

Zhou Xin 等[16]報道了1 例21 歲女性在睡眠中發生SUD 的事件，通過基因篩查發現其祖母、母親、女兒均攜帶LQTS 致病基因KCNQ1c.686G＞A（p.G229D）突變，遺傳分析推測本案中猝死女性也是該突變攜帶者，通過定點誘導pEGFP-KCNQ1-N1 質粒產生G229D 突變并轉染倉鼠卵巢細胞（CHO-K1），經全細胞膜片鉗檢測發現G229D 突變通過產生復極后未失活的尾電流導致QT 間期延長和傳導延遲，表明G229D 突變可引起攜帶者心電傳導異常和竇房結功能障礙。Furushima 等[17]報道了1 例母親產后1 個月出現QT 間期延長（QTc ＞ 490 ms），其胎兒在妊娠期間出現2∶1 房室傳導阻滯，并于產后1 周QT 間期顯著延長（QTc ＞ 521 ms），對母嬰進行KCNQ1基因全外顯子測序發現2 人均攜帶KCNQ1-T587M 突變。WuJie 等[17]通過p-GFP 質粒將KCNQ1-T587M 突變轉染到穩定表達hERG 蛋白（KCNH2基因編碼的K+通道蛋白）的人胚腎細胞中，全細胞膜片鉗檢測結合熒光能量共振轉移技術發現該突變通過降低IKr電流同時干擾hERG 蛋白向細胞膜轉運的機制導致長QT 綜合征的嚴重表型。

馮莉等[18]對1 例LQTS 伴暈厥患者（靜息心電圖QTc：488 ms，動態心電圖QTc：610 ms）進行了22 個心臟疾病相關基因外顯子及鄰近內含子區的遺傳學篩查，結果發現其攜帶KCNH2-F129I突變，應用定點誘導pcDNA3.1-KCNH2質粒突變、脂質體轉染人胚腎細胞后，采用全細胞膜片鉗技術并結合蛋白質免疫印跡法進行功能和表達研究，結果顯示KCNH2-F129I 突變通過干擾hERG 蛋白向細胞膜轉運引起通道蛋白減少而導致IKr電流顯著減弱，幾乎無法單獨形成功能性IKr通道。

SCN5A致病基因突變的功能研究報道較KCNQ1、KCNH2基因更多，這可能因為SCN5A基因同樣作為Brugada 綜合征、病態竇房結綜合征等致猝死性心率失常等疾病的致病基因有關。Daniel 等[19]構建了攜帶人源SCN5A基因野生型和R222Q 突變型的小鼠，通過膠原酶/蛋白酶法從10～14 周小鼠心臟分離獲取心肌細胞和浦肯野細胞，利用全細胞膜片鉗技術檢測兩種細胞的鈉電流（INa），結果顯示R222Q 型小鼠心肌細胞和浦肯野細胞的動作電位時程出現不同程度縮短，其中心肌細胞INa的電導（表示導電能力）明顯增大，激活、失活電流以及通道由激活變為失活的“窗電位”均向負極移動；而浦肯野細胞的早期后除級（Early afterdepolarizations）膜電位向負電壓方向移動-60 mV，上述改變均與LQTS 的發病機制有關并可能導致個體發生心律失常甚至猝死。

隨著人類對離子通道疾病研究的不斷深入，膜片鉗技術已經成為研究細胞水平電生理的常用技術。而全細胞膜片鉗技術在LQTS 患者的遺傳學診斷和治療等方面具有指導價值。對于法醫學病理學領域，全細胞膜片鉗技術對于評估LQTS致病基因突變的危害性、篩查LQTS 引發SUD 高風險人群以及明確SUD 案例死亡原因等問題均具有重要意義。