兩種氟苯尼考注射液在雞體內比較藥動學研究

楊 潔，李慧素，彭 麗，孟 蕾，張盼盼，吳寧鵬

(河南省獸藥飼料監察所，鄭州 450008)

氟苯尼考(Florfenicol，FFC)，是80年代后期成功研制的一種動物專用酰胺醇類廣譜抗菌藥，1990年首次在日本上市，同年在韓國上市，而后相繼在挪威、法國、英國、奧地利、墨西哥及西班牙等上市[1]，我國于1999年批準上市。氟苯尼考具有毒性低，對環境污染小，殺菌作用強、不易產生耐藥性和其他藥物沒有交叉耐藥性等優點被廣泛應用于巴氏桿菌和大腸埃希菌感染，對呼吸道系統感染和腸道感染療效顯著[1-3]。我國至今已批準氟苯尼考子宮注入劑、氟苯尼考可溶性粉、氟苯尼考注射液、氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液、氟苯尼考預混劑、氟苯尼考膠囊等7種劑型在牛、豬、雞、魚、蠶等動物上使用[4]。仿制藥品需選用原研品為參比制劑，但先靈葆雅動物保健公司法國廠生產的氟苯尼考注射液僅批準用于豬，我國獸藥典(2020版)批準氟苯尼考注射液可用于豬、雞和魚使用，因此，選擇河南某公司生產的雞用氟苯尼考注射液為參比制劑，進行比較藥動學試驗，考察兩種制劑間的差異，以期為實驗室自制氟苯尼考注射液工藝優化提供參考。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜儀(美國Waters公司，Acquity UPLC)；高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；IKA MS3 basic漩渦儀(艾卡廣州儀器設備有限公司IKA中國))；TTL-DCⅡ型氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；Milli-QA10 超純水儀(美國MiLipore公司)。乙腈(色譜純，美國Merck公司)；磷酸二氫鉀、正己烷、乙酸乙酯(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；

1.2 藥品和試劑的配制 氟苯尼考注射液，10 mL∶1 g(實驗室自制)。氟苯尼考注射液，10 mL∶1 g，批號：17101701(河南某公司生產)。氟苯尼考對照品(純度99.1%，批號：K0301703，購自中國獸醫藥品監察所)。氟苯尼考標準儲備液配制：精密稱取氟苯尼考對照品10.07 mg，于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃下保存，有效期為3個月；pH 7.0磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 M NaOH溶液29.1 mL，用水稀釋至100 mL；乙腈水飽和的正己烷：向正己烷溶液中加入乙腈水(23∶77)即可。

2 方 法

2.1 試驗動物 選擇體重約1.83±0.24 kg的健康黃羽肉雞30只，公母各半，購自鶴壁市永達食品有限公司，常規飼養，自由飲水和采食，飼料為不含抗菌藥物的全價日糧。

2.2 試驗設計和給藥方案 30只雞隨機分為兩組，每組各15只。給藥時以氟苯尼考計，均按照20 mg/kg bw的劑量單劑量肌內注射給藥。

2.3 血樣采集 給藥前禁食12 h，給藥4 h后恢復正常飲食。雞采用側臥方式保定，用2.5 mL注射器翼下靜脈采血。分別在給藥前及給藥后0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48 h采血，每次采血約1.5 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，4000 r/min離心10 min取上層血漿，-20 ℃保存。

2.4 檢測條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈：水(23∶77)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：223 nm；進樣量：10 μL。

2.5 血漿樣品前處理 血漿樣品自然解凍后，取血漿500 μL于離心管中，加入500 μL pH 7.0磷酸鹽緩沖液，混勻后再加入2 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，以10000 r/min離心10 min，吸取全部上清液于15 mL離心管中，用乙酸乙酯重復提取1次，合并有機相，于40 ℃水浴氮氣吹干，用0.5 mL流動相復溶，混勻后再加0.5 mL乙腈水飽和的正己烷，渦旋混勻，6000 r/min離心10 min，吸取下層澄清液體。過0.22 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜儀測定。

2.6 方法學

2.6.1 特異性 取空白血漿、待測血漿樣品，按2.5項血漿樣品前處理后和濃度2.5 μg/mL 氟苯尼考對照品同時上機檢測，觀察出峰附近有無干擾。

2.6.2 標準曲線 取7份空白血漿樣品，按2.5項血漿樣品前處理下操作至氮氣吹干，準確移取0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL 氟苯尼考系列濃度各0.5 mL，溶解殘余物。上機檢測，以藥物濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，求回歸方程和相關系數。

2.6.3 檢測限和定量限 取空白血漿樣品，進行不同濃度的添加回收試驗，按2.5項血漿樣品前處理處理樣品，再按2.4項檢測條件分析測定，依照信噪比S/N≥3為檢測限(Limit of detection，LOD)，S/N≥10為定量限(Limit of quantification，LOQ)。

2.6.4 準確度與精密度 取空白血漿，配制成0.1、2、4、8 μg/mL四個添加濃度的氟苯尼考溶液，每個濃度5個平行樣品，共做3個批次，按2.5項血漿樣品前處理方法處理樣品，再按2.4項檢測條件分析測定。

2.6.5 穩定性 取空白血漿，配制成0.1、2、4、8 μg/mL四個添加濃度的氟苯尼考血漿樣品，分別置于4 ℃下放置48 h，-20 ℃條件下存放30 d，反復凍融3次后，按2.5項血漿樣品前處理方法處理樣品，再按2.4項檢測條件分析測定，考察樣品放置穩定性。

2.7 數據分析 根據UPLC-UV分析所得血藥濃度，用WinNonlin 8.1藥代動力學軟件進行非房室模型計算各組藥代動力學參數，SPSS 20.0比較藥動學參數的差異顯著性，并用GraphPad Prism 6.0制作藥時曲線圖。

3 結果與分析

3.1 方法學結果

3.1.1 特異性 在本試驗條件下測得氟苯尼考的保留時間為2.7 min，血漿樣品中氟苯尼考與血漿雜質峰分離效果較好，峰形良好，血漿中其它物質對氟苯尼考的測定無干擾(圖1)。

A：空白血漿色譜圖；B：氟苯尼考血漿樣品色譜圖；C：氟苯尼考對照品色譜圖(std 2.5 μg/mL)；A：Chromatogram of the blank plasma；B：Chromatogram of florfenicol plasma sample；C：Chromatogram of florfenicol(std 2.5 μg/mL)；圖1 氟苯尼考色譜圖Fig 1 Chromatogram of florfenicol

3.1.2 標準曲線 在0.1～10.0 μg/mL濃度范圍內，氟苯尼考色譜峰面積與濃度呈線性相關，回歸方程為y=83443x-279.5，r=0.9999，呈良好的線性關系，符合分析要求。

3.1.3 檢測限和定量限 依照信噪比S/N≥3為檢測限，S/N≥10為定量限，氟苯尼考在血漿中的檢測限為0.05 μg/mL，定量限為0.1 μg/mL。

3.1.4 準確度與精密度 空白血漿添加樣品在0.1～8 μg/mL范圍內，平均回收率在93.2%～97.1%之間，批內、批間變異系數在1.4%～6.2%之間，回收率穩定，適用于雞血漿樣品中氟苯尼考的測定，具體見表1。

表1 雞血漿中氟苯尼考血藥濃度方法回收率及精密度Tab 1 Florfenicol result of recovery test in chicken plasma

3.1.5 穩定性 氟苯尼考血漿樣品分別在4 ℃下放置48 h，-20 ℃條件下存放30 d，反復凍融3次后，檢測結果表明，平均回收率在92.1%～97.5%之間，變異系數在1.7%～5.2%之間，穩定性保持良好，具體結果見表2。

表2 血漿樣品穩定性結果Tab 2 results of plasma sample stability

3.2 藥動學特征 雞單劑量(20 mg/kg bw)肌內注射氟苯尼考參比制劑和受試制劑后，兩種制劑的平均血藥濃度見表3，主要藥代動力學參數見表4，不同時間測得的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

表3 兩種制劑的平均血藥濃度(μg/mL)Tab 3 Mean plasma concentrations of the two preparations

表4 兩種制劑的主要藥代動力學參數Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of the two preparations

圖2 兩種制劑的平均藥時曲線圖Fig 2 Mean plasm concentration-time curves of two preparations

4 討 論

4.1 前處理方法的優化 血漿中氟苯尼考的提取，大多采用乙腈[5-7]、乙酸乙酯[8-11]或pH 7.0磷酸鹽緩沖液和乙酸乙酯[12-14]等作為提取液，本文分別比較了三者的區別，發現乙酸乙酯比乙腈的回收率高，可達到86%以上，但當先加pH 7.0磷酸鹽緩沖液，再加乙酸乙酯時，回收率更高，可達到90%以上，因此最終采用磷酸鹽和乙酸乙酯組合提取。這可能與0.5%氟苯尼考水溶液pH值為4.5～6.5呈弱酸性，而乙腈主要起沉淀蛋白作用，但磷酸鹽緩沖液具有鹽平衡緩沖作用，乙酸乙酯能從水溶液中有效萃取氟苯尼考有關[15]。樣品用流動相復容后，發現溶液比較渾濁，又加入乙腈水飽和正己烷進一步除脂，溶液澄清且能更好的溶解上機檢測。

4.2 藥動學特征 氟苯尼考在雞體內的藥動學研究報道較多，劉芳等[11]報道雞分別內服15 mg/kg bw的10%氟苯尼考粉和19.91%氟苯尼考粉后，Cmax分別為5.11 μg/mL和5.78 μg/mL，Tmax分別為1.90 h和0.60 h，t1/2分別為7.51 h和9.16 h，MRT為5.69 h和4.36 h，AUC0→t分別為25.749(μg/mL)h和26.47(μg/mL)h；Ehab等[16]報道雞內服20 mg/kg bw兩種10%氟苯尼考口服液后，Cmax分別為9.02 μg/mL和9.20 μg/mL，Tmax分別為1.02 h和1.05 h，t1/2分別為1.41 h和1.35 h，MRT為2.72 h和2.62 h，AUC0→t分別為26.45(μg/mL)h和26.06(μg/mL)h；Liu Y等[6]報道4周齡肉雞內服20 mg/kg bw氟苯尼考后，Cmax為3.87 μg/mL，Tmax為0.63 h，t1/2為3.27 h，MRT為16.96 h，AUC0→t分別為8.58(μg/mL)h；Husamettin等[13]報道雞內服40 mg/kg bw氟苯尼考溶液后，Cmax為7.46 μg/mL，Tmax為1.5 h，AUC0→t為51.95(μg/mL)h；EMA[17]報道肉雞單次靜注54.4 mg/kg bw氟苯尼考注射液后，血清中氟苯尼考濃度從5 min的58.5 μg/mL，到8 h下降到0.069 μg/mL，10 h后未檢出，t1/2為0.61 h；本試驗雞單次肌注20 mg/kg bw受試制劑后，t1/2為(3.39±2.65)h，Tmax為(0.66±0.30)h，Cmax為(7.06±2.35)μg/mL，AUC0→t為(19.05±5.79)(μg/mL)h，MRT為(3.25±1.25)h。可以看出，雞在給藥劑量相同，給藥方式和藥物制劑不同時，Ehab試驗達峰濃度和藥時曲線下面積最大，Liu Y試驗達峰最快，本試驗消除半衰期最長；雞在給藥方式相同，給藥劑量和藥物制劑不同時，Ehab試驗雞內服氟苯尼考口服液達峰濃度最高，劉芳試驗內服10%氟苯尼考粉達峰最慢，Husamettin試驗雞內服40 mg/kg bw氟苯尼考溶液藥時曲線下面積最大。

在不同動物體內肌注20 mg/kg bw氟苯尼考注射液后：張志娟等[9]報道豬體內Cmax為5.74 μg/mL，Tmax為2.4 h，t1/2為11.78 h，MRT為16.96 h，AUC0→t為85.21(μg/mL)h；Holmes等[18]報道成年羊駝體內Cmax為4.31 μg/mL，Tmax為1 h，t1/2為17.59 h，MRT為21.01 h，AUC0→t為51.83(μg/mL)h；Sheetal等[19]報道山羊體內Cmax為3.07 μg/mL，Tmax為0.5 h，t1/2為0.65 h，MRT為6.24 h，AUC0→t為20.6(μg/mL)h。可以看出，氟苯尼考在不同動物體內，給藥劑量和給藥方式相同的情況下，雞體內達峰濃度最高，山羊體內達峰最快，成年羊駝體內消除最慢，豬體內藥時曲下面積最大，平均駐留時間最長。

綜上所述，雞單劑量肌內注射20 mg/kg bw受試制劑和參比制劑后，雖然藥動學參數無顯著性差異(P>0.05)，但相比參比制劑，受試制劑的消除半衰期短，達峰快，達峰濃度低，藥時曲線下面積小，平均駐留時間短，相對生物利用度較低，僅為87.55%，兩種制劑的工藝可能差異較大。