UFLC-MS/MS法同時測定龍膽中7個活性成分的含量

關 皎，舒欣洋，吳 燕，張雯鈺，婁 云，范琢玉，湯鑫淼，朱鶴云，崔 悅*，馮 波*

(1. 吉林醫藥學院 藥學院，吉林吉林 132013；2. 深圳技師學院，廣東深圳 518116)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽GentianamanshuricaKitag.、龍膽GentianascabraBge.、三花龍膽GentianatrifloraPall. 或堅龍膽GentianarifescensFranch. 的干燥根和根莖。文獻報道，其能抗抑郁、保肝、抗炎、抗氧化、保護心肌等[1-5]。在獸藥領域，主治馬、牛、駝、羊等獸類的濕熱黃疸、目赤腫痛、濕疹瘙癢。獸藥制劑如：龍膽瀉肝散、龍膽碳酸氫鈉片、復方龍膽酊等[6]中也有應用。因此，其質量控制方法研究對于控制龍膽藥材以及含有龍膽的復方制劑具有重要意義。《中國獸藥典》2015年版中收載的龍膽質量控制指標為龍膽苦苷。然而，龍膽中其他化學成分，如馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷、異葒草苷和異牡荊素亦具有多種藥理活性[7-12]。因此，對龍膽中的多種活性成分進行質量控制十分必要。課題組前期采用了HPLC、UFLC等多種分析技術建立了相關質量控制方法[13-14]，研究在此基礎上，建立了UFLC-MS/MS方法，同時測定龍膽藥材中的7個活性成分，可為龍膽藥材的質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 3200 QTRAP質譜儀(美國AB Sciex)，Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(日本島津)，FW80型粉碎機(天津泰斯特)，N-1300-WB型旋轉蒸發儀(日本EYELA)。

1.2 試藥 藥品對照品，其中馬錢苷酸(批號：111865-202005)、獐牙菜苦苷(批號：110785-201404)、龍膽苦苷(批號：110770-201918)和異葒草苷(批號：111974-201401)購自中國食品藥品檢定研究院，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(批號：180420)、獐牙菜苷(批號：140401)、異牡荊素(批號：18053107)購自成都普菲德生物技術有限公司，純度均大于98 %。乙腈和甲醇為色譜純(美國Fisher)。龍膽藥材購自吉林市吉林大藥房，吉林醫藥學院李景華副教授鑒定為真品。

1.3 色譜與質譜條件

1.3.1 色譜條件 Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm，2.2 (m)，以0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)為流動相；梯度洗脫(0～12 min，10%→30%B；12～18 min，30%→55%B)，流速為0.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣量5 μL。

1.3.2 質譜條件 采用的離子源為電噴霧離子源，即ESI源，正離子檢測，源噴霧電壓和輔助加熱氣溫度分別為5500 V、550 ℃，多重反應監測(MRM)進行掃描，檢測的離子反應分別為m/z377.2→m/z215.2(馬錢苷酸)、m/z375.2→m/z195.2(獐牙菜苦苷)、m/z519.2→m/z195.2(6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷)、m/z357.2→m/z195.2(龍膽苦苷)、m/z359.2→m/z197.1(獐牙菜苷)、m/z449.1→m/z 299.2(異葒草苷)和m/z433.2→m/z 283.2(異牡荊素)。上述7個成分的碰撞能量(CE)分別為13 eV、11 eV、20 eV、10 eV、12 eV、33 eV和35 eV。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品儲備液 分別精密稱取7個對照品適量并置于5 mL容量瓶中，用甲醇配制成濃度為1.0 mg·mL-1的各成分對照品儲備液。

1.4.2 供試品溶液 取龍膽藥材粉末0.1 g于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶劑20 mL，超聲提取30 min，濾過后取續濾液1 mL，離心后用0.22 μm微孔濾膜過濾，所得即為供試品溶液。

1.5 線性關系考察 吸取上述各對照品溶液，用甲醇配制成系列混合對照品溶液，其中馬錢苷酸濃度分別為2.5、5、10、25、50和 100 μg·mL-1，獐牙菜苦苷濃度為1、2、4、10、20和 40 μg·mL-1，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷濃度為1、2、4、10、20和 40 μg·mL-1，龍膽苦苷濃度為5、10、20、25、50和 100 μg·mL-1，獐牙菜苷濃度為0.1、0.2、0.4、1、2和 4 μg·mL-1，異葒草苷濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1和 2 μg·mL-1，異牡荊素濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.1、0.2和 0.4 μg·mL-1。將上述樣品于UFLC-MS/MS聯用儀中分析，同時記錄峰面積。回歸方程的橫坐標是對照品的濃度(μg·mL-1)，縱坐標是峰面積積分值。

1.6 精密度試驗 吸取上述混合對照品溶液，并連續進樣6 次。

1.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液于室溫下放置不同時間，于不同時間點(0、2、4、8、12、24 h)分析。

1.8 重復性試驗 取同一批龍膽樣品6 份，按上述方法得到供試品溶液；并分析測定，計算待測成分的含量。

1.9 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批次龍膽樣品9份，每份0.05 g，分別加入相當于樣品中各測定成分含量80 %，100 %，120 %的對照品溶液適量各3份，并制備供試品溶液，進樣分析。

1.10 樣品含量測定 稱取6批龍膽樣品并制備供試品溶液，分析測定，計算7個待測成分在龍膽中含量。

2 結果與分析

2.1 質譜與色譜圖 7種成分的產物離子掃描質譜圖見圖1，混合對照品和龍膽樣品的MRM色譜圖見圖2和圖3。

圖1 馬錢苷酸(A)、獐牙菜苦苷(B)、6'-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(C)、龍膽苦苷(D)、獐牙菜苷(E)、異葒草素(F)、異牡荊素(G)的正離子產物離子掃描質譜圖Fig 1 Full scan product ion spectra of loganic acid(A) swertiamarin(B) 6'-O-β-D- glucosylgentiopicroside(C) gentiopicroside(D) swertioside(E) isoorientin(F) isovitexin(G) in positive ionization mode

1. 馬錢苷酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；4. 龍膽苦苷；5. 獐牙菜苷；6. 異葒草苷；7. 異牡荊素1. Loganic acid; 2. Swertiamarin; 3. 6′-O-β-D- glucosylgentiopicroside; 4. Gentiopicroside；5. Swertioside；6. Isoorientin；7. isovitexin圖2 混合對照品的MRM色譜圖Fig 2 MRM chromatograms of mixed reference substances

1. 馬錢苷酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；4. 龍膽苦苷；5. 獐牙菜苷；6. 異葒草苷；7. 異牡荊素1. Loganic acid; 2. Swertiamarin; 3. 6′-O-β-D- glucosylgentiopicroside; 4. Gentiopicroside；5. Swertioside；6. Isoorientin；7. isovitexin圖3 龍膽樣品的MRM色譜圖Fig 3 MRM chromatograms of Gentianae Radix Et Rhizoma sample

2.2 線性關系考察 7個成分的線性方程分別為：

Y= 5.716×103X+ 1.677×104r= 0.9996

Y= 2.088×104X+ 1.520×104r= 0.9995

Y= 1.441×104X+ 1.637×104r= 0.9995

Y= 2.221×104X+ 1.283×105r= 0.9996

Y= 3.574×104X-3.155×103r= 0.9995

Y= 2.462×104X+ 1.121×102r= 0.9998

Y= 5.731×104X- 2.823×101r= 0.9995

以上結果說明，上述7個成分分別在2.5～100 μg·mL-1、1～40 μg·mL-1、1～40 μg·mL-1、5～200 μg·mL-1、0.1～4 μg·mL-1、0.05～2 μg·mL-1和0.01～0.4 μg·mL-1具有良好的線性關系。

2.3 精密度試驗 7個成分峰面積RSD值分別為2.8%、1.6%、1.4%、1.7%、2.6%、1.9%和2.5%，即儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗 7個成分峰面積RSD分別為2.0%、1.8%、2.4%、1.7%、1.7%、2.4%和2.6%，表明供試品在24 h 內穩定性良好。

2.5 重復性試驗 7個成分含量的平均值和峰面積RSD分別為0.644%(1.6%)、0.184%(1.9%)、0.155%(2.3%)、3.24%(1.6%)、0.00610%(2.2%)、0.00101%(2.1%)和0.000576%(2.6%)，即方法重復性符合要求。

2.6 加樣回收率試驗 結果見表1。

表1 龍膽樣品中7個成分的回收率Tab 1 Recoveries of seven analytes in Gentianae Radix Et Rhizoma

2.7 含量測定 6批樣品測定結果見表2。

表2 龍膽樣品中7個成分的含量(%)Tab 2 The contents of seven analytes in Gentianae Radix Et Rhizoma (%)

3 討論與結論

3.1 色譜和質譜條件的優化 實驗中考察了不同種類的流動相組成，最終確定采用0.1%甲酸-乙腈作為流動相。通過分析時間和流動相比例的調整，優化后的梯度洗脫程序為0～12 min，10%→30%B；12～18 min，30%→55%B，此條件可將7個待測物成功分離，獲得較好的分離效果。7個待測物在ESI源正離子模式響應較高。各待測成分主要形成的準分子離子均為[M+H]+且信號穩定，具體質荷比如下：馬錢苷酸為m/z377.2、獐牙菜苦苷為m/z375.2、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷為m/z519.2、龍膽苦苷為m/z357.2、獐牙菜苷為m/z359.2、異葒草苷為m/z449.1、異牡荊素為m/z433.2，各離子靈敏度較高且信號較穩定。通過考察不同的碰撞能量(CE)，最終確定上述各待測成分的CE值分別為13 eV、11 eV、20 eV、10 eV、12 eV、33 eV和35 eV。本研究建立的UFLC-MS/MS分析方法同時測定龍膽中7個活性成分，與已有方法比較[13-14]，分析成分多、分離效果好、分析時間短、靈敏度高。

3.2 龍膽指標成分的選擇 實驗前期，為了能夠較全面完整地完成龍膽的質量標準研究，對龍膽的指標成分進行了選擇。龍膽的主要化學成分包括環烯醚萜苷類、黃酮類、三萜類、木脂素類、生物堿等[15-16]。《中國獸藥典》2015年版中僅以龍膽苦苷為考察指標，測定指標較為單一，且僅用一種成分控制龍膽藥材的質量也有一定局限性。馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷為龍膽中的環烯醚萜苷類成分，異葒草苷和異牡荊素為龍膽中的黃酮類成分。文獻報道，馬錢苷酸具有抗炎活性[7]，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷具有保肝、降脂。促進細胞增殖等作用[8-10]。異葒草苷能夠抗病毒[11]，異牡荊素具有降糖、抗菌等多種藥理活性，近年來，有研究表明其對心肌細胞的瞬時外向鉀電流亦具有明顯的抑制作用[12]。因此，選擇上述7個成分作為龍膽質量控制的指標成分。

3.3 龍膽藥材的含量測定 本研究建立了UFLC-MS/MS方法對龍膽中的7個活性成分進行了含量測定，7個活性成分的含量順序由高到低依次為：龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異牡荊素、獐牙菜苷、異葒草苷。總體來看，環烯醚萜苷類含量要高于黃酮類成分。

3.4 結論 本研究首次建立了一種UFLC-MS/MS方法可同時測定龍膽中的7個環烯醚萜苷類和黃酮類活性成分的含量。該方法成功地測定了龍膽中上述成分的含量。本研究建立的UFLC-MS/MS方法具有分析時間短、分離效果好、靈敏度高等優點，可為龍膽在獸藥領域的質量控制標準的提高提供參考。