結核分枝桿菌感染的免疫學檢測技術研究進展及臨床應用現狀

賈紅彥 董靜 張宗德 潘麗萍

據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)估算，全球約1/4的人口感染結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1]。我國是結核病高負擔國家之一，MTB感染比例較高，約為20%[2-3]。WHO呼吁2035年消除結核病需要對結核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)進行干預。然而，LTBI的診斷仍缺乏金標準，免疫學檢測技術是實現MTB感染診斷的主要方法。此外，結核病的確診需要依靠病原學實驗室檢查，但并非所有結核病患者都能夠獲得病原學診斷依據。據2018年數據統計，我國肺結核患者的病原學陽性率不足40%，肺外結核病原學陽性率更低[4]。根據最新的《肺結核診斷》行業標準，依賴于免疫學檢測的MTB感染診斷結果已經成為重要的結核病輔助診斷依據。

宿主免疫系統與MTB的相互作用決定了MTB感染機體的結局。MTB入侵宿主后引發的免疫病理反應及抗結核免疫應答反應是開發免疫學診斷技術的基礎，參與免疫應答不同階段(天然免疫和適應性免疫)的各類細胞亞型、細胞因子、趨化因子、抗體等，都是潛在的免疫學診斷靶標。筆者主要對已經應用于臨床實踐的免疫學診斷技術原理、應用現狀，以及處于研發和探索階段的免疫學診斷技術的預期應用潛力進行簡要概述。

一、應用于臨床的MTB感染檢測技術

1. 血清學診斷：血清學診斷是以宿主感染MTB后的體液免疫應答為基礎，檢測MTB抗原或抗體，主要基于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、酶聯免疫膠體金滲濾法、膠體金免疫層析法、蛋白芯片技術等。由于具有操作簡單快速、實驗技術要求低、價格低廉等優點，曾經是我國結核病診斷的重要輔助手段。但是，2011年WHO對94項商業化結核病血清學檢測試劑盒進行了系統評估，認為血清學檢測試劑的敏感度(0%～100%)和特異度(31%～100%)變化巨大，存在大量假陽性或假陰性結果，故不推薦使用[5]。WHO的上述建議直接影響血清學診斷在臨床中的應用。血清學診斷不確定性的原因復雜，可能與抗原選擇及生產工藝差別有關。

目前，有多項研究提示結核抗原檢測對于結核病的診斷是有價值的，包括脂阿拉伯甘露聚糖抗原(lipoarabinomannan，LAM)、早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigentic target 6，ESAT-6)、培養濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)、Ag85抗原復合物及MPT64抗原等[6]。國際研發的基于LAM抗原的側向流動型尿液檢測，在HIV感染人群中診斷敏感度較高，而且隨著CD4+T細胞數量降低，診斷敏感度優勢越發明顯[7]。WHO根據國際多中心研究數據分別于2015年和2019年制定和修訂了關于尿液LAM檢測的建議，推薦在HIV感染人群中使用。

WHO雖然在2011年否定了當時商業化血清學診斷試劑盒的應用，但并未限制結核新型抗原和新的診斷標識物的研究，當前的臨床診斷現狀也迫切需要發現新型抗原和分子標識物。通過客觀準確的鑒定和評價體系篩選合適的抗原或抗原組合是未來血清學檢測發展的方向和關鍵[8-9]。

2. 皮膚試驗：結核菌素皮膚試驗(tuberculin test，TST)基于遲發型超敏反應，已沿用上百年。在未出現更先進的免疫學診斷技術前，TST檢測是檢測MTB感染的重要工具，也是結核病的重要輔助診斷工具。但是，由于傳統的結核菌素使用結核菌素純蛋白衍生物，因此容易與卡介苗或非結核分枝桿菌產生交叉反應，導致特異度低。研究提示，在未接種卡介苗的人群中，TST檢測的特異度可以達到97%，但在接種卡介苗的人群中，TST檢測的特異度僅為59%，臨床應用受限[10]。

目前，國內外都在研發新型皮膚變態反應原。一項在南非開展的臨床試驗提示，新型C-Tb皮膚試驗，使用ESAT-6和CFP-10抗原混合物，在結核病患者中的診斷敏感度(73.9%)與γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)持平(75.1%)，在健康人群中的特異度(99.3%)明顯高于傳統TST(76.9%)，與IGRA檢測持平(100%)[11]。國內也有類似研究，將ESAT-6和CFP-10融合蛋白(EC)作為變態反應原，替代原來使用的結核菌素純蛋白衍生物。臨床試驗提示，EC蛋白在診斷MTB感染中能夠排除卡介苗干擾，優于傳統TST，與IGRA檢測結果有良好的一致性，已獲得國內臨床應用許可[12]。新型皮膚試驗的研發為MTB感染診斷和結核病輔助診斷提供了新的方法。得益于其操作便利性和技術要求低等優點，更適合在結核病基層防控機構推廣實施。

3. IGRA：IGRA是以宿主感染MTB后的細胞免疫應答為基礎，通過檢測MTB特異抗原刺激后釋放 γ-干擾素(IFN-γ)的特異性淋巴細胞數量(酶聯免疫斑點法，ELISPOT)或直接檢測IFN-γ水平(酶聯免疫吸附法，ELISA)來判斷機體是否感染MTB，是目前診斷MTB感染的有效工具，也是診斷結核病的重要輔助工具。IGRA技術于2001年獲得美國食品藥品監督管理局(FDA)批準，延用至今，期間不斷有進口試劑盒的更新換代和各類國產試劑盒的問世。

不同國家和地區也對該技術在各類人群中的診斷價值給予了較完善的評估。由于納入MTB特異抗原ESAT-6和CFP-10，該技術能夠排除卡介苗的干擾，對于MTB感染的診斷效果較好[13]。基于IGRA檢測獲得的全球及我國LTBI率均明顯低于TST[2]。該技術在活動性結核病患者中的診斷敏感度優于TST檢測，陰性預測值較好，但由于無法與LTBI進行鑒別，在結核病高負擔國家中的診斷特異度較低，常用于結核病患者的排除，而非納入。在結核病低負擔國家，該技術的診斷敏感度和特異度均優于TST檢測，對于活動性結核病的診斷幫助較大[14]。在結核病發病風險預測方面，盡管IGRA檢測的陽性預測值、陰性預測值略高于TST檢測，但依然無法準確預測結核病發病[15]。在兒童群體中，薈萃分析提示IGRA檢測和TST檢測基本一致，并未表現出更好的診斷性能，因此并不推薦以IGRA替代TST用于兒童結核病的輔助診斷[16]。但是，IGRA檢測在HIV感染、自身免疫疾病和器官移植人群的診斷敏感度優于TST，臨床實踐中建議單用IGRA檢測或者聯用TST檢測，優先使用基于ELISPOT方法的檢測[13]。

IGRA檢測主要適用于外周血檢測，但也有研究探索了該技術在不同體液中的應用價值，發現基于ELISPOT方法的IGRA檢測的診斷性能優于基于ELISA方法的IGRA檢測[13,17]。近年來，有研究提出可應用IGRA檢測中結核特異抗原免疫應答與陽性抗原免疫應答的比值(TBAg/PHA ratio)作為鑒別活動性結核病和LTBI的指標，但仍需要基于前瞻性大樣本隊列對該比值進行進一步評價[18-19]。在臨床實踐中，存在一定比例(5%～20%)的確診結核病患者的IGRA檢測結果為陰性，原因比較復雜，包括高齡、HIV感染、免疫抑制狀態、疾病進程、外周血淋巴細胞數量低、體質量指數(BMI)和人類白細胞抗原(HLA)分型等，其中外周血淋巴細胞數量低主要影響基于ELISA方法的IGRA檢測結果[20]。

當前也有一些研究試圖通過改變IGRA檢測中的特異性抗原，獲得更好的診斷性能[21]。最近的一項研究在聯用原有ESAT-6和CFP-10基礎上，依次加入新抗原Rv3615c和Rv3879c，雖然敏感度較結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)有所提升，但特異度也相應下降，并沒有表現出更好的診斷性能[22]。QuantiFERON-TB Gold plus診斷試劑納入了針對CD4+T細胞和CD8+T細胞免疫應答的抗原，希望提升診斷敏感度，實現不同感染狀態的鑒別診斷。但基于目前對其價值評估的薈萃分析數據，并沒有體現出鑒別診斷結核病和LTBI的能力，但其診斷結核病和MTB感染的敏感度略高于其他QuantiFERON-TB診斷試劑[23-24]。對于改良型IGRA檢測的研究，未來可能需要嘗試更多的新型抗原。

4. 干擾素誘導蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10，IP-10)：在活動性結核病早期診斷標識物的研究中，發現結核病患者外周血中存在一種高表達的細胞因子，即IP-10。IP-10主要來源于單核/巨噬細胞和T淋巴細胞，是IFN-γ免疫應答通路中一個高表達的CXC家族趨化因子，與IFN-γ受到同一信號通路的調控[25]。

有研究證實，將QuantiFERON-TB Gold試劑盒(IGRA的一種)中的檢測靶標替換成IP-10蛋白，也適合于MTB特異性細胞免疫反應檢測[26]。薈萃分析提示，靶向IP-10蛋白檢測用于診斷結核病的敏感度和特異度可達到86%(95%CI：80%～90%)和88%(95%CI：82%～92%)，對LTBI的診斷敏感度和特異度分別為85%(95%CI：80%～88%)和89%(95%CI：84%～92%)[27-28]。研究發現，在結核特異抗原刺激后2.5～8 h內，IP-10 mRNA的表達量顯著上調，上調倍數明顯高于IFN-γ，而且能在較長時間內保持穩定的高表達。因此，IP-10 mRNA可能更適合作為MTB特異性細胞免疫反應檢測的靶標[29]。

目前，國內外關于IP-10 mRNA檢測用于MTB感染診斷或結核病輔助診斷的研究有限。國外一項研究平行比較了IGRA檢測、IP-10蛋白檢測和IP-10 mRNA檢測在MTB感染中的診斷價值，發現結核特異抗原刺激后的IP-10 mRNA檢測的診斷特異度與IGRA檢測和IP-10蛋白檢測基本一致，但是敏感度略低于其他兩個靶標[30]，這可能與結核抗原刺激時間的選擇以及RNA提取方案有關。通常情況下，mRNA轉錄窗口期較短，較長時間的抗原刺激后可能已進入IP-10蛋白累積階段，mRNA含量下降。因此，鎖定恰當的結核抗原刺激時間，捕獲處于高表達狀態的mRNA對于提高檢測性能至關重要。國內也有研究分析了IP-10 mRNA 的檢測性能，以結核特異抗原刺激后4 h作為檢測時間點，IP-10 mRNA檢測與IGRA檢測在診斷MTB感染中獲得了基本一致的敏感度和特異度，在HIV與MTB雙重感染者中表現出更高的診斷敏感度和更低的不確定結果獲得率[25,31]。

5. IFN-γ/白細胞介素(IL)-2雙因子檢測：IL-2是重要的Th1類細胞因子之一，既往研究發現，結核抗原刺激外周血淋巴細胞后，MTB感染者中IL-2表達量較未感染者明顯升高。薈萃分析提示，在IFN-γ基礎上增加IL-2檢測可以提高MTB感染的檢出率[32]。Suzukawa等[33]發現，包括IFN-γ和IL-2在內的多個細胞因子均與結核病相關，且聯合檢測IFN-γ和IL-2的受試者工作特征曲線下面積(AUC)大于其他因子的聯合檢測結果。這些研究均提示IFN-γ和IL-2 聯合檢測可以提高結核病的檢出率。

然而，關于IFN-γ和IL-2聯合用于活動性結核病和LTBI鑒別診斷的價值，一直存在爭議。有研究認為，IGRA檢測上清中IFN-γ/IL-2比值有助于鑒別診斷結核病和LTBI[34]，也有研究發現長時間刺激后(72 h)增加IL-2檢測可幫助鑒別診斷結核病和LTBI[35]。也有一些不一致結果，顯示聯合檢測IFN-γ和IL-2并不能鑒別診斷結核病和LTBI[36]。國內2020年上市的IFN-γ/IL-2雙因子檢測試劑盒，在常規IGRA檢測中增加IL-2檢測，臨床試驗數據提示增加IL-2可提高MTB感染的診斷敏感度，但未提及關于結核病和LTBI的鑒別診斷。因此，對于IFN-γ和IL-2聯用的價值，尚需要在前瞻性大樣本中做進一步評估。此外，國外開發的基于Ala-DH抗原刺激下的IL-2檢測試劑，在成人和兒童的活動性結核病和LTBI鑒別診斷中表現出較好的敏感度(100%)和特異度(96%和81%)，提示開發基于新型結核抗原刺激下的多因子檢測，可能有希望實現活動性結核病和LTBI的診斷[37-38]。

6. B細胞ELISPOT檢測：B 細胞ELISPOT可用來直接計數抗體分泌細胞和長期記憶B細胞，是分析抗體免疫反應的有力工具，并且是僅有的少數能直接聚焦于抗體分泌細胞(antibody-secreting cell，ASC)的分析方法之一。B細胞ELISPOT能在10萬個細胞中實現對單個抗原特異性B細胞進行定量檢測，因而具有極高的敏感度[39]。相對于常用的細胞流式檢測技術而言，B細胞ELISPOT技術能夠幫助研究人員識別樣品中的ASC，并測量其總數以及那些對特定抗原分泌抗體的細胞數量，目前主要用于檢測B細胞對感染的反應和疫苗引發的反應。研究表明，卡介苗接種人群中由卡介苗引發的MTB特異的記憶性B細胞比例明顯高于未接種者[40]。在MTB感染及結核病的診斷中，相對于T細胞介導的細胞免疫而言，對B細胞及其抗體在結核免疫中作用的研究相對較少。早期研究發現，活動性結核病患者中存在功能缺陷的B細胞亞群，表現為增殖受限、抗體及細胞因子釋放受損等，提示B細胞在結核病免疫應答中起著重要作用[41]。Gindeh等[42]利用B細胞ELISPOT技術研究發現結核病患者外周血中ESAT-6/CFP-10特異的漿母細胞比例明顯高于密切接觸者及LTBI者，而且在抗結核治療后明顯降低，提示B細胞ELISPOT技術用于診斷結核病的潛在價值。另一項研究也提示活動性結核病患者中存在較高水平的卡介苗特異的IgG+漿母細胞，其與LTBI者和非結核病患者間的比例差異明顯，可作為活動性結核病診斷的分子標識[43]。但是由于目前關于B細胞各亞群在宿主抗結核免疫應答中的作用并未完全闡明，因此目前B細胞ELISPOT檢測技術用于結核病診斷的價值研究仍然需要進一步深入探討。

二、新型MTB感染檢測靶標和技術的研發進展

1. 細胞因子檢測：新的診斷技術需要新的靶標，國內外研究者一直致力于探尋除IFN-γ之外的其他因子，希望通過單獨或綜合檢測的方式來提高結核病或MTB感染的診斷能力。到目前為止，納入評估的細胞因子超過100種，包括白細胞介素類(IL1α/β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27等)、趨化因子類(CXCL家族、CXCR家族、MIP-1α/β、MCP、RANTES、I-309 等)，以及其他細胞因子(TNF-α、VEGF、GM-CSF、G-CSF、MMP-9、TGF-β等)。一項薈萃分析對56項研究進行了綜合分析，其中研究最多的是IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10、IL-10和IL-13。盡管多數研究認為各類細胞因子具有鑒別診斷結核病和LTBI的潛質，但各研究之間的異質性很高，并沒有得到非常統一的結果[44]。分析原因，可能與各研究入組人群、研究設計、樣本性質及檢測方法有關。未來針對結核抗原特異細胞因子的研究，應該基于更加成熟的設計，分別在兒童和成人群體中單獨分析。

2. 多功能淋巴細胞亞型：細胞免疫應答在MTB感染引起的宿主適應性免疫應答過程中起到重要作用。結核抗原刺激后的T淋巴細胞，因分泌多種細胞因子而被認為是多功能細胞(poly-functional T cells)，表現為不同的細胞亞型和功能。在結核病研究中發現，分泌不同細胞因子的多功能T細胞亞型的數目和比例可能與不同的MTB感染狀態相關[45]。早在2011年，Harari等[46]發現，單分泌TNF-α的CD4+T細胞數目在LTBI和活動性結核病中的比例存在明顯差異，而且在治療后明顯降低，可能是鑒別診斷活動性結核病和LTBI的標識物。Rozot等[47]構建了基于單分泌TNF-α的CD4+T細胞比例和結核抗原特異的CD8+T細胞數目的診斷模型，可用于活動性結核病和LTBI的鑒別診斷。其后多項研究提示，針對釋放IFN-γ和TNF-α的多功能淋巴細胞檢測有助于活動性結核病和LTBI的診斷和鑒別診斷[48-49]。也有研究發現，釋放IFN-γ并表達CD38、HLA-DR、Ki-67蛋白的CD4+T細胞能夠鑒別診斷活動性結核病和LTBI，而且可能作為監測治療效果的標識物[50]。目前看來，應用流式細胞儀或者多色免疫熒光技術檢測特異性抗原刺激后釋放多種細胞因子的淋巴細胞亞型，對于實現MTB感染的診斷，甚至是活動性結核病和LTBI的鑒別診斷可能具有較好的意義，但至今尚無相關的診斷試劑用于臨床實踐[51]。

3. 新型生物標識物：通過蛋白質組學技術系統篩選活動性結核病和LTBI的宿主免疫應答標識物，是開發新型免疫學檢測技術的重要源動力。2006年，Agranoff等[52]率先采用表面增強激光解析飛行時間質譜技術篩選獲得了結核病血漿特異蛋白，并基于支持向量機數學模型構建了由20個蛋白組成的結核病診斷模型。到目前為止，全球研究者開展了至少20余項結核病高通量特異蛋白組研究，篩選獲得了上百種宿主蛋白，具有結核病診斷和鑒別診斷的潛在價值，近5年就有10余項研究(表1)。然而，早期的大多數研究止步于系統篩選階段，近年來的少數研究才開展了診斷模型構建和盲法驗證，但仍無確定的生物標識物達到臨床應用階段。其中比較有代表性的包括：De Groote等[53]應用不同數學模型在722個候選蛋白中獲得了一組蛋白診斷模型，在三組不同人群中分別獲得了較好的診斷價值(AUC為 0.89～0.94)；Yang等[54]開展了一項基于蛋白芯片中640個蛋白的篩選和驗證，最終獲得了一組由8個蛋白組成的、可有效區分結核病和LTBI，以及結核病和非結核肺部疾病的結核病診斷分子標識組合；Sun等[55]建立了一組由3個蛋白組成的、可用于結核病和LTBI鑒別診斷的標識組合。但是，所有這些數據在應用于臨床實踐之前，均需要更加嚴格的多中心、多人群獨立驗證。

表1 結核病特異蛋白標識的研究匯總

三、展望

近年來，結核病免疫診斷技術的研發取得了巨大進展，特別是在IGRA技術之后，相繼出現了基于IP-10檢測和IL-2檢測的MTB感染診斷新技術，一方面提高了MTB感染的檢出率，另一方面在免疫低下等特殊人群中表現出較好的診斷價值。盡管這些新型的細胞免疫檢測技術仍然無法實現活動性結核病和LTBI的鑒別診斷，但足以提示除IFN-γ外，必然存在其他細胞因子或標識物能夠指示MTB的不同感染狀態。隨著對MTB感染后宿主免疫應答機制的深入探討，必然能夠找到更理想的生物標識物，以提高MTB感染和結核病免疫學診斷的敏感度和特異度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻賈紅彥：文獻查閱、起草文章初稿；董靜：文獻查閱；張宗德：稿件審閱修改；潘麗萍：文獻審閱、初稿修改及審校