去甲斑蝥素通過Nrf2通路保護(hù)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的機(jī)制

余 恒，宋光捷

湖北省文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，襄陽(yáng) 441003

缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是足月新生兒出生時(shí)因缺氧窒息引起的一種臨床綜合征，是導(dǎo)致新生兒急性死亡的重要原因，多由胎盤脫離、臍帶脫垂和子宮破裂導(dǎo)致［1-3］。研究表明，細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激激活和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)等過程均參與了HIE 的發(fā)生和發(fā)展［4］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控抗氧化酶、抗凋亡蛋白等基因的表達(dá)參與氧化應(yīng)激和癌變過程，在多種氧化應(yīng)激損傷、炎癥損傷和惡性腫瘤疾病中扮演重要角色［5］。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化活性的小分子合成化合物，在膽管癌、肝癌、食管鱗癌等癌癥中具有較好的控制腫瘤的作用［6］。本研究探究NCTD 預(yù)處理介導(dǎo)Nrf2通路對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KH22R 型冷凍高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

NCTD（山東仁和堂藥業(yè)有限公司）；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和 腫 瘤 壞死因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，均購(gòu)自上海研啟生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

60只7日齡新生SD 大鼠購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（鄂）2017-0065。

2 方法

2.1 分組及藥物預(yù)處理

60只7日齡新生SD大鼠于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，調(diào)節(jié)光暗周期為12 h，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12只。造模開始前以NCTD預(yù)處理，低劑量組、中劑量組、高劑量組幼鼠分別給予0.025、0.05、0.1 mg·kg－1·d－1的NCTD 灌胃處理，假手術(shù)組和模型組給予等劑量的生理鹽水灌胃處理，各組均持續(xù)灌胃1周。

2.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建

各組幼鼠經(jīng)相應(yīng)的處理后，除假手術(shù)組外，其余48只新生幼鼠均采用改良Rice-Vannucci法［7］構(gòu)建缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，術(shù)前以體積分?jǐn)?shù)為3%異氟醚麻醉后，術(shù)中以體積分?jǐn)?shù)為2%異氟醚進(jìn)行維持，頸部開切口，暴露頸總動(dòng)脈，以5.0外科縫合線進(jìn)行結(jié)扎，術(shù)后將幼鼠置于熱毯上恢復(fù)1 h，再將其置于含體積分?jǐn)?shù)92%氮?dú)夂腕w積分?jǐn)?shù)8%氧氣混合氣體的透明密封罐中，并持續(xù)注入混合氣體2.5 h，保持37℃、相對(duì)濕度65%。當(dāng)觀察到幼鼠蘇醒后左轉(zhuǎn)圈和左前肢屈曲表明建模成功。假手術(shù)組幼鼠僅切開暴露頸動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎，也不進(jìn)行密閉缺氧處理。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定

造模成功24 h后依據(jù)Zea-Longa法［8］對(duì)各組幼鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，當(dāng)幼鼠無異常表現(xiàn)時(shí)記0分，出現(xiàn)左前肢伸展無不全等輕度神經(jīng)功能缺陷表現(xiàn)時(shí)記1分，出現(xiàn)頻繁向左轉(zhuǎn)圈等中度神經(jīng)功能缺陷表現(xiàn)時(shí)記2分，出現(xiàn)傾倒、翻轉(zhuǎn)等重度神經(jīng)功能缺陷表現(xiàn)時(shí)記3分，出現(xiàn)喪失自主意識(shí)、無法行走等嚴(yán)重神經(jīng)功能缺陷表現(xiàn)時(shí)記4分，幼鼠死亡記5分。

2.4 腦積水量測(cè)定

造模成功24 h后將各組幼鼠安樂死，取出腦組織，依據(jù)干濕質(zhì)量法檢測(cè)腦積水量，稱取幼鼠左腦組織質(zhì)量作為濕質(zhì)量，72℃干燥72 h后再次稱質(zhì)量，并將其作為干質(zhì)量。腦積水量＝［（左腦組織濕質(zhì)量－左腦組織干質(zhì)量）÷左腦組織濕質(zhì)量］×100%。

2.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Td T mediated d UTP nick end labeling，TUNEL）［9］檢測(cè)幼鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，取幼鼠腦組織制成石蠟切片，脫蠟、脫水后與蛋白酶K（質(zhì)量濃度20μg·m L－1）室溫下共同孵育20 min，用緩沖液多次洗滌后加入TUNEL試劑50μL避光孵育1 h。用緩沖液多次洗滌后加入過氧化氫溶液避光孵育20 min，與過氧化物酶標(biāo)記的工作液混合30 min，用二氨基聯(lián)苯胺染色液顯色后復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片等步驟后觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。

2.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

取各組幼鼠腦組織，加入緩沖液于冰上高速離心，收集上清液，按照酶活性試劑盒說明書中的步驟操作，分別檢測(cè)腦組織上清液中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）的含量。

2.7 炎癥因子檢測(cè)

取各組幼鼠腦組織，加入緩沖液于冰上高速離心，收集上清液，用IL-6、IL-10和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒分別檢測(cè)腦組織上清液中IL-6、IL-10 和TNF-α的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.8 Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取各組幼鼠腦組織，用裂解液裂解后提取總蛋白，用二奎啉酸法測(cè)定蛋白含量，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至膜，室溫下封閉1 h后與稀釋過的Nrf2、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］和β-actin單克隆抗體于4℃下孵育過夜，用緩沖液多次洗滌后與標(biāo)記后的二抗室溫下孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光液顯影后，用ImageJ軟件分析以β-actin作為內(nèi)參時(shí)各組蛋白的灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組幼鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦積水量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的比較

與假手術(shù)組比較，其余各組缺氧缺血幼鼠神經(jīng)功能評(píng)分均顯著下降，腦積水量顯著增多，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組隨著NCTD 劑量增加，幼鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著改善，腦積水量減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

與假手術(shù)組比較，其余各組缺氧缺血幼鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)MAD 的含量顯著上升，SOD 和GSH-PX的含量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組隨著NCTD 劑量增加，MDA 的含量隨之下降，SOD 和GSH-PX的含量隨之上升（P＜0.05）。

與假手術(shù)組比較，其余各組缺氧缺血幼鼠炎癥因子指標(biāo)IL-6和TNF-α的水平顯著上升，IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組隨著NCTD 劑量增加，IL-6 和TNF-α的水平隨之降低，IL-10 水平隨之上升（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組幼鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦積水量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的比較（±s，n＝12）Tab.1 Comparison of neurological function score，hydrocephalus volume，nerve cell apoptosis rate，oxidative stress indicators and inflammatory factors among the groups（±s，n＝12）

表1 各組幼鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦積水量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的比較（±s，n＝12）Tab.1 Comparison of neurological function score，hydrocephalus volume，nerve cell apoptosis rate，oxidative stress indicators and inflammatory factors among the groups（±s，n＝12）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

項(xiàng)目 神經(jīng)功能評(píng)分／分 腦積水量 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率MDA／（mmol·mL－1）SOD／（U·L－1）GSH-PX／（U·L－1）IL-6／（pg·mL－1）IL-10／（pg·m L－1）TNF-α／（pg·mL－1）假手術(shù)組 0.00±0.00 74.13%±4.89% 1.01%±0.99% 2.29±0.31 12.87±1.31 18.25±1.8 4 23.18±3.54 15.11±4.61 48.95±6.75模型組 3.11±0.48* 89.35%±9.78%* 45.12%±5.03%* 5.45±0.52* 4.53±0.95*9.63±0.97* 79.16±5.88* 4.57±2.23* 179.66±15.15*低劑量組 2.87±0.39*＃ 84.47%±6.62%*＃ 37.81%±4.12%*＃ 4.68±0.44*＃ 7.11±0.78*＃ 12.15±1.12*＃ 51.63±4.12*＃ 7.78±3.75*＃ 135.48±8.69*＃中劑量組 1.75±0.41*＃ 80.04%±8.94%*＃ 25.66%±3.07%*＃ 3.57±0.38*＃ 8.84±0.91*＃ 14.78±1.39*＃ 43.27±3.98*＃ 9.66±3.16*＃ 98.63±7.18*＃高劑量組 1.09±0.28*＃ 76.75%±7.51%*＃ 12.34%±1.68%*＃ 2.96±0.40*＃ 10.33±1.22*＃ 16.69±1.63*＃ 32.08±3.77*＃ 12.37±4.12*＃ 61.55±6.61*＃F 95.115 10.625 492.693 174.511 203.389 126.716 440.172 26.081 578.128 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.2 各組幼鼠Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

與假手術(shù)組比較，其余各組幼鼠腦組織內(nèi)Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，經(jīng)NCTD 預(yù)處理的低劑量組、中劑量組和高劑量組幼鼠腦組織內(nèi)Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達(dá)水平顯著上升，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。結(jié)果見圖1、表2。

圖1 Western blot檢測(cè)各組幼鼠Nrf2通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of Nrf2 pathway-related proteins in young rats of each group detected by Western blot

表2 各組幼鼠Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s，n＝12）Tab.2 Comparison of expression levels of Nrf2 pathway-related proteins among the groups of young rats（±s，n＝12）

表2 各組幼鼠Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較（±s，n＝12）Tab.2 Comparison of expression levels of Nrf2 pathway-related proteins among the groups of young rats（±s，n＝12）

注：與 假 手 術(shù) 組 比 較，*P ＜0.05；與 模 型 組 比 較，＃P＜0.05。

項(xiàng)目Nrf2 HO-1 NQO1假手術(shù)組1.01±0.10 1.00±0.11 1.00±0.09模型組 0.15±0.02* 0.21±0.03* 0.11±0.02*低劑量組 0.33±0.04*＃ 0.33±0.05*＃ 0.18±0.02*＃中劑量組 0.54±0.06*＃ 0.49±0.06*＃ 0.39±0.04*＃高劑量組 0.83±0.08*＃ 0.81±0.07*＃ 0.56±0.06*＃F 338.236 272.55 539.021 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 討論

NCTD 是斑蝥類化合物的主要生物活性成分，通過調(diào)控Wnt／β-catenin、MAPK 等信號(hào)通路的活化水平，發(fā)揮顯著的抗腫瘤效應(yīng)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，影響免疫反應(yīng)和淋巴管生成［10］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 還具有增強(qiáng)免疫、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集和抑制腎間質(zhì)纖維化的 作 用［11］。SHEN H B 等［12］的 研 究 表明，NCTD 可通過調(diào)節(jié)Th17／Treg免疫平衡和炎癥反應(yīng)，抑制膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-6、白細(xì)胞介素-17和TNF-α水平，對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠有較好的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 可劑量依賴性抑制HIBD模型幼鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能評(píng)分，減少腦積水量，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮顯著的腦保護(hù)作用，這與NCTD 的抗炎、抗氧化生物活性有關(guān)［13］，通過調(diào)節(jié)MDA、SOD、GSH-PX等氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥介質(zhì)水平，保護(hù)模型幼鼠的神經(jīng)功能和腦組織免受缺氧缺血誘導(dǎo)的損傷。

氧化應(yīng)激在HIE 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，當(dāng)發(fā)生HIE時(shí)，抗氧化劑和促氧化劑間的平衡被打破，并趨向于氧化狀態(tài)，大量的活性氧被釋放，而過量的活性氧導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA 大分子的水平，引起蛋白酶分泌、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)［14］，進(jìn)而加重腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 可顯著提高HIBD 幼鼠腦組織中SOD、GSH-PX的含量并提高IL-10 的水 平，降 低MDA 的含量和IL-6和TNF-α的水平，使氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)被顯著抑制，從而改善模型大鼠神經(jīng)的功能，減輕腦組織損傷。推測(cè)這可能與NCTD 對(duì)模型幼鼠腦組織中免疫細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，NCTD 通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的活性，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌和活性氧的產(chǎn)生［15］，避免腦組織中由炎性環(huán)境形成造成的損傷，平衡中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、黏附分子、細(xì)胞因子和趨化因子間的相互作用，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮顯著的腦保護(hù)作用。

Nrf2信號(hào)通路是目前公認(rèn)的與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)的經(jīng)典通路，Nrf2及其依賴的HO-1和NQO1基因具有抗氧化損傷、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和促血管生成效應(yīng)［16-18］，在多種炎癥損傷疾病及氧化應(yīng)激損傷疾病中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NCTD 可劑量依賴性活化Nrf2 信號(hào)通路，上調(diào)Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善模型幼鼠神經(jīng)功能評(píng)分，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，減少腦積水量，減輕腦損傷，這也與GAO Y 等［19］的研究結(jié)果相符。NCTD 對(duì)Nrf2信號(hào)通路的激活機(jī)制可能與其對(duì)Nrf2基因從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核異位的誘導(dǎo)作用有關(guān)，NCTD 活化Nrf2，并進(jìn)一步刺激其下游HO-1和NQO1等酶活性［20］，提示Nrf2／HO-1／NQO1 可 能 是 治 療HIBD 的 潛 在靶點(diǎn)。

綜上所述，NCTD 對(duì)于HIBD 幼鼠具有腦保護(hù)作用，可顯著改善模型幼鼠神經(jīng)功能，減少腦積水量，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。相關(guān)的機(jī)制研究表明，NCTD的腦保護(hù)作用是通過激活Nrf2通路、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。本研究為臨床治療HIBD 提供了新的分子依據(jù)和理論證明，NCTD 可能成為治療HIBD 的有效藥物。