姜黃素對大鼠重癥急性胰腺炎炎癥反應的影響及其機制研究*

蔣春櫻，石靜，仲海艷

（常州市第四人民醫院 消化內科，江蘇 常州 213000）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是消化科常見危重癥，主要表現為胰腺壞死出血，易出現胰腺膿腫、假性囊腫等并發癥，伴有臟器功能障礙及代謝功能紊亂等，嚴重時可導致多器官功能障礙綜合征，給患者生命健康帶來嚴重威脅[1]。目前臨床尚無有效的特異性方法，因此探尋SAP 治療方法仍是臨床研究的重點和難點。SAP 發病機制復雜，有研究表明SAP 是一種炎癥反應性疾病，其炎癥反應機制仍未完全闡明[2]。

姜黃素是從中藥姜黃中提取出的一種多酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抑癌作用[3]。既往研究顯示，姜黃素可減輕胰腺炎大鼠胰腺組織損傷，但作用機制尚未完全統一[4-5]。既往研究顯示，抑制JAK2/STAT3 通路活化可減輕胰腺炎大鼠腸道功能損傷及炎癥反應[6]。石青青等[7]研究顯示，姜黃素可通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷。目前姜黃素對胰腺炎胰腺組織損傷的保護作用是否與調控JAK2/STAT3 通路有關，少見報道。故本研究基于JAK2/STAT3 通路探究姜黃素對SAP 大鼠胰腺炎癥的影響，以期為治療SAP 提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50 只SPF 及SD 大鼠，10 周齡，體重190～220 g，平均（205±15）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0264。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑姜黃素，規格25 g，純度＞95%（上海廣銳生物科技有限公司），牛磺膽酸鈉，規格20 mg（滁州仕諾達生物科技有限公司），醋酸地塞米松溶液，規格25 mg（深圳振強生物技術有限公司），白細胞介素6（interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色試劑盒（上海吉至生化科技有限公司），兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體及山羊抗兔HRP 二抗（上海依赫生物科技有限公司）。

1.2.2主要儀器Optima?XPN 超速離心機（美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司），BSA2202S-CW型電子分析天平（北京科邦興業科技有限公司），BD-SW50 光學顯微鏡（深圳市博視達光學儀器有限公司），Selectra E 型全自動生化分析儀及其配套試劑（上海玉研科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1SAP 模型的復制及分組將50 只大鼠隨機分為假手術組、SAP 模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組、陽性對照組，每組10 只。其中SAP 模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組、陽性對照組大鼠自由飲水、禁食12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定于手術臺。常規消毒、鋪巾后，于腹部正中切開，暴露十二指腸，識別胰膽管匯入十二指腸系膜乳頭開口處，在其下緣腸壁無血管區用注射器針頭穿刺，置入5 cm 硬膜外導管并朝向開口方向緩慢推進5 cm，結扎胰膽管下段及硬膜外導管，于導管末端連接輸液轉換器，泵入5%牛磺膽酸鈉溶液（1 mL/kg），流速為0.2 mL/min，2 min后胰腺組織出現水腫、出血等，去除結扎絲線及動脈夾，復位十二指腸并逐層縫合腹壁[8]；假手術組大鼠僅翻動十二指腸、胰腺，不穿刺注藥，其余操作同SAP 模型組。

1.3.2藥物處理模型復制過程中SAP 模型組、姜黃素低劑量組大鼠各死亡1 只，均剩9 只。SAP模型復制完成后，姜黃素低、高劑量組大鼠即刻腹腔注射姜黃素50 mg/kg、200 mg/kg[9]，陽性對照組腹腔注射2 mg/kg 地塞米松[10]，假手術組、SAP 模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。以上藥物均連續使用3 d。

1.3.3標本采集各組大鼠藥物干預結束后進行消毒麻醉，打開腹腔后用干棉球吸取腹水。取腹主動脈血，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取血清，-80℃保存備用。處死大鼠，取胰腺組織并分為兩部分，一部分經4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，用于病理染色；一部分保存于液氮中，用于蛋白檢測。

1.3.4腹水量測定用電子分析天平記錄干棉球重量（干重）、吸取腹水后重量（濕重），計算腹水量（mg）=棉球濕重（mg）-棉球干重（mg）[11]。

1.3.5各組大鼠血清淀粉酶（Amylase,Amy）、炎癥因子IL-6、TNF-α水平測定 從-80℃冰箱中取出凍存血清樣本后解凍，采用全自動生化分析儀測定大鼠血清Amy 水平；ELISA 測定血清IL-6、TNF-α 水平，所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行[12]。

1.3.6HE 染色取各組大鼠胰腺組織，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續切片厚約6 μm，進行HE 染色[13]。中性樹膠封片，采用雙盲法，由2 位病理科醫師用光學顯微鏡觀察各組大鼠胰腺組織病理學變化后進行病理學評分。病理學評分標準參照改良的Schmidt 法[14]，依據水腫、炎癥細胞浸潤、腺泡壞死嚴重程度及范圍進行病理學評分。

1.3.7Western blotting 檢測各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3 通路蛋白的表達取各組大鼠胰腺組織，制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3，內參β-actin（均按1∶1 000 稀釋），次日加入HRP 標記山羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋），室溫孵育2 h，顯色、顯影、定影，根據各蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量[15]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腹水量、血清Amy水平比較

5 組大鼠腹水量、血清Amy 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組腹水量和血清Amy 水平升高（P＜0.05）；姜黃素低、高劑量組及陽性對照組腹水量、血清Amy 水平低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組腹水量、血清Amy 水平低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腹水量、血清AMY水平比較 （±s）

表1 各組大鼠腹水量、血清AMY水平比較 （±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與SAP 模型組比較，P ＜0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P ＜0.05。

Amy/（u/L）1 381.22±207.19 5 638.78±845.82①4 312.78±647.92①②2 010.12±302.50①②③2 006.12±300.92①②③120.073 0.000組別假手術組SAP模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F 值P 值n 10 991 0 10腹水量/mg 0.68±0.11 6.75±1.02①3.98±0.60①②1.51±0.23①②③1.47±0.23①②③203.527 0.000

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較

5 組大鼠血清IL-6、TNF-α 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組血清IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；姜黃素低、高劑量組及陽性對照組血清IL-6、TNF-α 水平低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組IL-6、TNF-α 水平低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 （±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與SAP 模型組比較，P ＜0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P ＜0.05。

TNF-α/（ng/L）163.01±25.45 468.79±70.32①277.66±41.65①②223.05±3.45①②③226.12±33.93①②③78.874 0.000組別假手術組SAP模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F 值P 值n 10 991 0 10 IL-6/（pg/mL）15.33±2.29 48.96±7.35①37.13±5.57①②28.62±4.30①②③27.97±4.21①②③59.637 0.000

2.3 各組大鼠胰腺組織病理學變化及病理學評分比較

假手術組大鼠胰腺組織結構清晰、形態正常，未見水腫、出血及炎癥細胞浸潤；SAP 模型組大鼠胰腺組織充血水腫、空泡化樣變，可見炎癥細胞浸潤及腺泡細胞壞死；與SAP 模型組比較，姜黃素低、高劑量組及陽性對照組大鼠上述病理學變化有所改善，且高劑量組及陽性對照組大鼠上述病理學變化更加明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理學變化 （HE染色×200）

假手術組、SAP 模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組、陽性對照組大鼠病理學評分分別為（1.33±0.20）分、（11.77±0.26）分、（8.69±1.31）分、（5.12±0.77）分、（5.06±0.76）分，經方差分析，差異有統計學意義（F=254.950，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組組織病理學評分升高（P＜0.05）；但姜黃素低、高劑量組及陽性對照組組織病理學評分低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組組織病理學評分低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3 通路蛋白相對表達量比較

5 組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，SAP 模型組、姜黃素低、高劑量組及陽性對照組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2 和p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；姜黃素低、高劑量組及陽性對照組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量低于SAP 模型組（P＜0.05）；姜黃素高劑量組及陽性對照組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量低于姜黃素低劑量組（P＜0.05）。見表3 和圖2。

圖2 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3通路蛋白的表達

表3 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3通路蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組大鼠胰腺組織JAK2/STAT3通路蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與SAP 模型組比較，P ＜0.05；③與姜黃素低劑量組比較，P ＜0.05。

p-STAT3/STAT3 0.23±0.03 0.87±0.13①0.60±0.09①②0.25±0.04①②③0.24±0.05①②③137.095 0.000組別假手術組SAP模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組陽性對照組F 值P 值n 10 991 0 10 p-JAK2/JAK2 0.16±0.03 0.99±0.15①0.76±0.11①②0.38±0.06①②③0.35±0.07①②③127.474 0.000

3 討論

SAP 是多因素誘發、多個臟器受累的炎癥反應性危重急腹癥，病情兇險，發展迅速，部分患者可引發全身性炎癥反應綜合征和多種器官衰竭，目前臨床仍缺乏有效的特異性治療方法。姜黃素是我國傳統中藥，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，且毒性低，副作用較少，對胰腺炎的防治發揮積極作用[16-17]，但治療機制尚未完全闡明。有研究表明，炎癥反應在SAP 導致的多臟器功能損傷中發揮關鍵作用。

胰腺炎早期特征是胰腺腺泡細胞局部壞死，促進促炎細胞因子，如IL-6、TNF-α 等的產生，并促使這些炎癥因子募集到炎癥發生部位，從而加劇胰腺損傷及病情進展[18]。由于腹腔內和腹膜后的炎癥刺激造成胰腺損傷，導致機體內液體分布改變并在腹腔內大量滲出，形成腹水[19]。血清Amy 是一種用于分解淀粉和高分子多糖的酶類物質，正常人體血清Amy 維持在一定水平，其異常升高常用于診斷胰腺炎[20]。本研究結果顯示，SAP 模型組大鼠胰腺組織充血水腫，可見炎癥細胞浸潤及腺泡細胞壞死，且大鼠腹水量，血清Amy、IL-6、TNF-α 水平及組織病理學評分升高，當姜黃素藥物干預后，大鼠胰腺組織上述病理學變化有所改善，且大鼠腹水量，血清Amy、IL-6、TNF-α 水平及組織病理學評分均一定程度降低，說明姜黃素可能通過抑制SAP 大鼠胰腺炎癥反應，進而對胰腺組織發揮保護作用。JAK/STAT通路是多種炎癥細胞因子信號轉導的共同通路之一，可介導多種細胞因子的細胞內信號，其中JAK2/STAT3 是JAK/STAT 通路中一條重要的炎癥信號通路，當JAK2 磷酸化反應被激活后，促使下游STAT3基因發生磷酸化反應生成p-STAT3，最終介導機體分泌IL-6、TNF-α 等促炎因子，導致炎癥加重[21]。既往研究結果顯示，抑制JAK2/STAT3 通路活化能夠抑制SAP 大鼠炎癥因子分泌，改善大鼠肺功能損傷[22]。本研究結果顯示，與假手術組比較，SAP 模型組大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量升高，當姜黃素藥物干預后，大鼠胰腺組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達量一定程度降低，說明姜黃素可能通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，抑制炎癥反應。

綜上所述，姜黃素對SAP 大鼠胰腺損傷發揮保護作用，可能是通過抑制JAK2/STAT3 通路活化，抑制炎癥反應來實現的，可為臨床有效治療SAP 提供一定參考。然而本研究并未能明確姜黃素對JAK2/STAT3 通路的具體調控作用，后期應進行深入研究。