MicroRNA-146a 對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞增殖及凋亡的影響及其機制研究*

王寶友，潘宏年，王修中，王鳳，汪發勇

（六安市人民醫院 消化內科，安徽 六安 237005）

急性胰腺炎是以胰腺局部炎癥反應為主要特征的急腹癥之一，具有起病急、進展快及病死率高的特點。有研究表明，胰腺腺泡細胞凋亡是急性胰腺炎發生、發展的關鍵[1-2]，因此探尋急性胰腺炎新型生物治療靶標有效抑制胰腺腺泡細胞凋亡已成為臨床研究熱點。MicroRNA（miRNAs）是一種內源性非編碼小分子RNA，參與細胞增殖、凋亡等生理過程[3]。MicroRNA-146a（miR-146a）是miRNAs 家族一員。張高峰等[4]研究顯示，急性重癥胰腺炎患者外周血miR-146a 水平顯著低于輕度胰腺炎患者，其異常低表達與病情嚴重程度有關。目前有關miR-146a 對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞的生物學影響尚未見報道，因此本研究探討miR-146a 對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡的影響，并分析相關機制，以期為臨床提高急性胰腺炎治療效果提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

大鼠胰腺腺泡細胞系MPC-83 細胞株購自北京百歐博偉生物技術有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、RPMI-1640 培養液（武漢純度生物科技有限公司），雨蛙素（純度≥98%，規格1 mg，上海恒斐生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor- α, TNF- α）、 白細胞介素 6（Interleukin-6, IL-6）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司），LipofectamineTM2000（上海遠慕生物科技有限公司），miR-146a-mimics-NC、miR-146a-mimics 序列由南通百奧邁科生物技術有限公司設計合成，凋亡雙染試劑盒（上海玉博生物科技有限公司）， 兔抗鼠增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein, Bax）、B 淋巴細胞瘤2（B cell lymphoma 2, Bcl-2）、核轉錄因子-κB p65（nuclear factor-κB p65, NF-кB p65）及內參甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）一抗、HRP 標記的山羊抗兔二抗（武漢菲恩生物科技有限公司）。

1.2.1主要儀器酶標儀（美國Thermo Fisher 公司），培養箱（日本Sanyo 公司），流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.3 MPC-83細胞培養及急性胰腺炎模型的構建

1.3.1細胞培養將MPC-83 細胞解凍并復蘇，于含10%滅活FBS、100 u/mL 青霉素、鏈霉素100 μg/mL的RPMI 1640 培養液，37℃、5%二氧化碳培養箱中培養，每2～3天換液1次（無菌操作），傳代培養。

1.3.2急性胰腺炎模型的構建模型建立前1 天取對數生長期的MPC-83 細胞按2.5×104個/孔的密度接種于24 孔板，培養24 h 后用100 nmol/L 雨蛙素刺激6 h，繼續培養12 h，收集上清液。采用ELISA檢測TNF-α、IL-6 水平。本研究顯示，雨蛙素處理的MPC-83 細胞TNF-α、IL-6 水平高于未經雨蛙素處理的MPC-83 細胞（P＜0.05），表明急性胰腺炎模型建立成功[5]，可用于后續實驗。

1.4 方法

1.4.1細胞轉染及分組取雨蛙素處理的細胞按2.5×104個/孔的密度接種于24 孔板，培養24 h 后更換無FBS 的培養液，隨機分為兩組。①陰性對照組（mimics-NC 組）： 采用LipofectamineTM2000 將mimics-NC 序列轉染至MPC-83 細胞；②過表達miR-146a 組（miR-146a-mimics 組） ： 采 用LipofectamineTM2000 將miR-146a-mimics 序列轉染至MPC-83 細胞。以未經雨蛙素處理的細胞為空白對照組（NG 組）。繼續培養細胞48 h，比較3 組細胞綠色熒光強度。每組設置6 個復孔，重復3 次。

1.4.2實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測細胞miR-146a 的表達分別提取3 組MPC-83 細胞總RNA 并測濃度，以RNA 為模板逆轉錄為cDNA，進行qRT-PCR 反應。反應體系20 μL：ULtra SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向引物各2.0 μL、去離子純化水4.0 μL。反應條件：95℃預變性15 s，60℃變性60 s，共40 個循環；熔解曲線：60℃、95℃，每15 秒升溫0.3℃。以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-146a 相對表達量。qRTPCR 引物由上海韻泰信息科技有限公司設計并合成，引物序列見表1。

1.4.3MTT法檢測細胞增殖取3 組MPC-83 細胞胰酶消化后按2.5×104個/孔的密度接種至24 孔板，每孔加入20 μL 質量濃度為5 mg/mL 的MTT 試劑，培養2 h 后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩，用酶標儀檢測490 nm 處各孔細胞光密度（optical density, OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞存活率（%）=實驗組OD 值/NG 組OD 值×100%。每組重復3 次。

1.4.4流式細胞儀檢測細胞凋亡取3 組MPC-83細胞，參照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒，取濃度為1×106個/mL的細胞懸液100 μL，加入5 μL Annexin V/PITC+10 μL PI（20 μg/mL），混勻，避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測凋亡率，每組重復3 次。

1.4.5ELISA 檢測細胞TNF-α、IL-6 水平收集3 組細胞上清液，采用ELISA 檢測各組細胞TNF-α、IL-6 水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.6Western blotting 檢測PCNA、Bax、Bcl-2、NFкB p65 蛋白的表達取3 組MPC-83 細胞，加入裂解液裂解30 min，離心取上清液，電泳、轉模，5%脫脂牛奶封閉3 h，加入兔抗鼠PCNA、Bax、Bcl-2、NF-кB p65 及內參GAPDH 作為一抗（1∶500稀釋），4℃過夜。加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶1 000 稀釋）孵育1 h。顯色、成像，計算蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染效果比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組miR-146a 相對表達量分別為（1.00±0.15）、（0.99±0.16）、（1.87±0.25），經方差分析，差異有統計學意義（F=408.873，P=0.000）。與mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組miR-146a 相對表達量升高（P＜0.05）。mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組可見較強綠色熒光，表明細胞轉染成功。見圖1。

圖1 細胞轉染效果 （×400）

2.2 各組細胞增殖情況比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組細胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（99.96±0.06）%、（128.69±8.97）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=499.735，P=0.000）。與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組細胞存活率升高（P＜0.05）。

2.3 各組細胞凋亡情況比較

NG組、mimics-NC組、miR-146a-mimics組細胞凋亡率分別為（39.11±5.86）%、（41.01±6.01）%、（18.76±2.82）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=407.634，P=0.000）。與NG組、mimics-NC組比較，miR-146amimics 組細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞流式細胞圖

2.4 各組細胞TNF-α、IL-6水平比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組細胞TNF-α、IL-6 水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=423.477 和391.410，均P=0.000）。與NG組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組細胞TNF-α、IL-6 水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞TNF-α、IL-6水平比較 （ng/L，x±s）

2.5 各組細胞PCNA、Bax、Bcl-2、NF-κB p65 蛋白相對表達量比較

NG 組、mimics-NC 組、miR-146a-mimics 組細胞PCNA、Bax、Bcl-2、NF-κB p65 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=345.536、352.413、322.885和342.213，均P=0.000）。與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組細胞PCNA、Bcl-2 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），Bax、NF-κB p65 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見圖3 和表3。

圖3 各組細胞PCNA、Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白的表達

表3 各組細胞PCNA、Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組細胞PCNA、Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白相對表達量比較 （±s）

注：?與NG組、mimics-NC組比較，P ＜0.05。

組別NG組mimics-NC組miR-146a-mimics組F 值P 值NF-κB p65 1.22±0.19 1.25±0.19 0.60±0.09?342.213 0.000 PCNA 0.80±0.12 0.77±0.12 1.26±0.19?345.536 0.000 Bax 0.96±0.14 0.98±0.15 0.36±0.05?352.413 0.000 Bcl-2 0.73±0.11 0.75±0.12 1.15±0.18?322.885 0.000

3 討論

急性胰腺炎是一種常見的危及生命的炎癥性疾病，其發病率隨人們生活水平提高呈逐年上升趨勢，但臨床治療方式仍以傳統支持治療為主，沒有較大改善，故病死率仍居高不下[6-7]。因此探尋新型生物治療靶標以提高急性胰腺炎的治療效果十分重要。

有研究表明，TNF-α 可使促炎因子IL-6 的合成和釋放，導致全身炎癥反應及多器官功能障礙綜合征，其是急性胰腺炎發生時較早升高的主要炎癥細胞因子[8-9]。既往研究表明，雨蛙素誘導的急性胰腺炎模型能很好地模擬人體急性胰腺炎發病機制，應用較多[10]。本研究采用雨蛙素誘導胰腺腺泡MPC-83 細胞的急性胰腺炎模型，結果顯示，經雨蛙素誘導的MPC-83 細胞TNF-α、IL-6 水平顯著高于未經雨蛙素誘導的細胞，說明急性胰腺炎細胞模型建立成功。

miRNAs 是由19～23 個核苷酸組成的單鏈小分子RNA，能夠調控靶基因的表達，參與炎癥反應、細胞增殖、凋亡等過程[11]。miR-146a 是較早證實的與炎癥相關的miRNAs 家族一員。既往研究報道，抑制miR-146a 表達可促進炎癥反應，進而促進小鼠糖尿病心肌病的發生、發展[12]。另有研究顯示，血清miR-146a 水平異常表達參與免疫炎癥疾病類風濕性關節炎的發生、發展[13]。既往研究結果顯示，外周血miR-146a 異常低表達參與急性胰腺炎發生、發展，且可以評估患者病情嚴重程度[4]。還有研究表明，胰腺腺泡細胞增殖及凋亡失衡是急性胰腺炎發生、發展的機制之一[14]。目前有關miR-146a 對急性胰腺炎胰腺腺泡細胞生物學行為的影響尚不清楚。PCNA 是細胞增殖狀態的評價指標。Bcl-2、Bax是人體最主要的抑凋亡、促凋亡基因[15]。本研究成功轉染MPC-83 細胞后，結果顯示，與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146amimics 組細胞存活率升高，凋亡率、Bax 蛋白相對表達量顯著降低，PCNA、Bcl-2 蛋白相對表達量顯著升高，說明上調miR-146a 表達可能抑制雨蛙素誘導的急性胰腺炎MPC-83 細胞凋亡，并促進細胞增殖。

NF-κB 是一種炎癥轉錄因子，主要以p50/p65二聚體形式與其抑制蛋白（inhibitor kappa, I-κB）形成復合體，存在于正常細胞中。在細胞因子的刺激下，促使p50/p65 二聚體與I-κB 發生解離并轉移至細胞核中，進而調控多種炎性介質（TNF-α、IL-6 等）的轉錄，促使大量炎癥細胞（中性粒細胞等）聚集，導致細胞損傷[16]。張敏劍等[17]研究結果表明，抑制NF-κB/IκB 信號通路活化可對急性胰腺炎肺損傷發揮保護作用。陳進城等[18]研究結果表明，過表達miR-146a 可通過抑制NF-κB 信號通路活化，改善頸型頸椎病模型兔頸部炎癥損傷。本研究結果顯示，與NG 組、mimics-NC 組比較，miR-146a-mimics 組NF-κB p65 蛋白相對表達量，TNFα、IL-6 水平顯著降低，與既往炎癥性疾病中表達模式一致，說明過表達miR-146a 可能通過抑制NF-κB 通路活化，從而抑制急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡。

綜上所述，上調miR-146a 表達可抑制急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡并誘導細胞增殖，其作用可能通過抑制NF-κB 通路活化來實現。本研究為探尋急性胰腺炎新型生物治療靶標有效治療急性胰腺炎提供了新的參考依據。