雞STAT家族成員鑒定及生物信息學(xué)分析

孟 婕，張明華，楊 晴，張 貝，李可強(qiáng)，張傳生，耿立英，李祥龍

(河北科技師范學(xué)院河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066004)

STAT(signal transducers and activators of transcription)是一種潛在的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞因子和生長因子受體信號傳導(dǎo)的下游效應(yīng)因子[1]。STAT家族在細(xì)胞受體相互作用過程中充當(dāng)載體，保持信號在細(xì)胞內(nèi)傳遞有內(nèi)在特異性，引導(dǎo)一部分細(xì)胞反應(yīng)，有控制細(xì)胞生長、分化、增殖免疫調(diào)節(jié)等功能[2～4]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT含有特定的STAT結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域，SH2作為最保守的STAT結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合特定磷酸酪氨酸基序的能力在信號傳導(dǎo)中起重要作用[5，6]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，STAT家族基因在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和免疫調(diào)節(jié)等生理過程中的作用復(fù)雜且重要，激活后的STAT基因可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種原癌基因的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[7]。STAT1被認(rèn)為在生長停滯和凋亡中起重要作用，并作為腫瘤抑制因子，而STAT3和STAT5則參與促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和防止凋亡[5，8～10]。Cuiping等發(fā)現(xiàn)STAT6在肺癌的間質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞中高表達(dá)，STAT6-/-腫瘤小鼠中CD11b+細(xì)胞的動(dòng)員和分化降低，STAT6的缺乏抑制腫瘤增殖[11]。

隨著雞基因組測序的完成，在基因組水平上研究雞STAT家族的信息成為一種可能。筆者采用生物信息學(xué)方法，對STAT基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列結(jié)構(gòu)特征、染色體定位和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析。同時(shí)，對3個(gè)物種進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期為進(jìn)一步研究STAT家族的功能、揭示雞STAT家族抗病分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雞STAT家族成員鑒定與序列特征分析

在Ensemble數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensemble.org/index.htm)，下載雞基因組序列信息和基因組基因結(jié)構(gòu)注釋信息文件。從Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)(http://pfam.xfam.org/)下載STAT蛋白的隱馬可夫模型(PF02865)，并以此作為查詢搜索雞可能STAT蛋白序列，進(jìn)一步在Batch CD-Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb.cgi)和SMART (http://smart.emble-heidellerg.de/)對其進(jìn)行驗(yàn)證分析，剔除不含STAT結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、其他結(jié)構(gòu)域及注釋不完整的序列，最終獲得雞STAT基因家族成員。利用在線工具ExPASy[12](http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測雞STAT家族成員理化性質(zhì)(等電點(diǎn)、蛋白分子量和氨基酸數(shù)量等屬性)。

1.2 雞STAT家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載人和家鼠的STAT蛋白序列，將它與雞STAT蛋白序列整合。通過MEGA-X[13]中的ClustalW將人、家鼠和雞STAT蛋白序列進(jìn)行多序列比對分析。并通過鄰接法(Neighblour-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值(Bootstrap)設(shè)定為1 000。

1.3 雞STAT家族成員motif及基因結(jié)構(gòu)分析

使用在線網(wǎng)站 MEME( http://meme-suiteorg/tools/meme) 對STAT蛋白序列的保守基序進(jìn)行預(yù)測分析，搜索motif值設(shè)定為10。STAT的外顯子和內(nèi)含子位置信息參考雞基因組注釋信息gff3文件，利用TBtools[14]軟件對其可視化分析。

1.4 雞STAT的染色體定位

利用TBtools軟件從基因組結(jié)構(gòu)注釋文件(gff3)中獲得雞STAT染色體位置信息，并通過其Gene Location Visualize from GTF/GFF功能制作染色體定位圖。

1.5 STAT家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對雞STAT蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并對STAT家族各成員的二級結(jié)構(gòu)類型在各成員中的占比和分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞STAT家族成員的鑒定及理化性質(zhì)

用生物信息學(xué)方法并對其進(jìn)行篩選驗(yàn)證，從雞全基因組中得到5條STAT基因序列。將5條雞STAT家族基因序列命名為ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A。對雞STAT家族進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，雞STAT家族的氨基酸序列長度最長為905 aa，最短的為749 aa(表1)。家族成員蛋白分子量最大的是99 826.43 ku，最小的是85 695.54 ku。從理論等位點(diǎn)來看，ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A的等電點(diǎn)均小于7，為酸性蛋白。其中，ChSTAT2等電點(diǎn)最小，為5.39。ChSTAT家族成員不穩(wěn)定系數(shù)大于40，鑒定其為不穩(wěn)定蛋白。ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A疏水性都小于0，都是親水蛋白。

表1 雞STAT基因家族基本信息

2.2 不同動(dòng)物STAT蛋白進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，雞的5個(gè)STAT基因可分為5組(圖1)。5個(gè)成員與家鼠和人的STAT家族成員分別聚集，說明STAT基因家族各成員相對較保守。STAT1和STAT4聚為一支，說明相較其他成員STAT1和STAT4親緣關(guān)系更近。

注：ChSTAT表示雞，HomoSTAT表示人，MusSTAT表示家鼠。遺傳距離標(biāo)尺在左下角。 節(jié)點(diǎn)上的值為通過Bootstrap檢驗(yàn)次數(shù)的百分?jǐn)?shù)。圖1 雞、家鼠、人STAT家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 雞STAT家族成員結(jié)構(gòu)特征分析

利用TBtools工具繪制了雞STAT家族成員的結(jié)構(gòu)特征圖。對雞STAT家族的5個(gè)成員進(jìn)行了蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，共獲取了10個(gè)motif元件(圖2)。不同STAT保守基元數(shù)量從4～10不等且分布不同，但同一分支基因所含保守基序個(gè)數(shù)及順序較為一致。其中STAT5A的編碼序列較其他成員簡單。基因成員均含有內(nèi)含子和外顯子。在同一分支的成員，基因結(jié)構(gòu)較相似。

2.4 雞STAT的染色體定位

從雞基因組中提取雞染色體長度、STAT基因在染色體上的位置等信息。結(jié)果顯示，ChSTAT定位在3條染色體上(圖3)。ChSTAT1和ChSTAT4定位在7號染色體；ChSTAT3和ChSTAT5A定位在27號染色體；ChSTAT2定位在33號染色體。

圖2 雞STAT家族成員結(jié)構(gòu)特征

圖3 雞STAT基因的染色體分布

表2 雞STAT家族蛋白質(zhì)二級預(yù)測 %

2.5 雞STAT家族蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

用SOPMA對雞STAT家族成員蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，雞STAT家族成員全部包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈及無規(guī)則卷曲，但各部分所占比例不同(表2)。ChSTAT2主要由無規(guī)則卷曲組成，其余4個(gè)成員主要由α-螺旋組成，β-轉(zhuǎn)角在各成員中所占比例最少。

3 結(jié)論與討論

STAT家族成員歸屬于一個(gè)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族，在各種動(dòng)物中都存在。STAT家族成員在小鼠及人中被研究較多[15，16]。不同的STAT基因之間通過相互作用共同參與免疫調(diào)節(jié)過程，對于維持機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡來說，當(dāng)某個(gè)STAT基因的表達(dá)失調(diào)時(shí)就可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。

本次研究通過隱馬可夫模型對雞基因組中STAT家族的搜索分析，鑒定獲得5個(gè)成員。從理論等位點(diǎn)來看，ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A的等電點(diǎn)均小于7，為酸性蛋白。ChSTAT家族不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，鑒定其為不穩(wěn)定蛋白。ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A疏水性都小于零，都是親水蛋白。以上分析推測雞STAT基因家族成員較易發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，STAT2，STAT4和STAT6負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，而STAT1，STAT3和STAT5(STAT5a和STAT5b)作用不同，它們可以調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞存活和血管生成等線管基因的表達(dá)，這些基因失調(diào)都會(huì)導(dǎo)致其活性增加，誘導(dǎo)疾病的發(fā)生[17～19]。

基因結(jié)構(gòu)是研究基因進(jìn)化和基因功能的重要依據(jù)。據(jù)STAT家族結(jié)構(gòu)特征分析可知，不同STAT保守基序數(shù)量從4～10不等，并且保守基序分布也是有所不同的，整體來說，亞家族STAT1～4保守基序分布有些許相似。STAT5A的編碼序列相比較其他亞家族簡單。經(jīng)過系統(tǒng)進(jìn)化分析可知，5個(gè)成員與家鼠和人的STAT家族成員分別聚集，表明基因保守性較強(qiáng)。相比之下，家鼠和人屬于同一分支再與雞相同基因聚集，說明物種間的差異較大。染色體定位顯示ChSTAT1和ChSTAT4定位在7號染色體；ChSTAT3和ChSTAT5A定位在27號染色體；ChSTAT2定位在33號染色體。結(jié)合基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在同一條染色體上的基因結(jié)構(gòu)整體較為相似。

預(yù)測分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對雞STAT家族的生物學(xué)研究是非常重要的。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)只有折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)才具有響應(yīng)的活性和生物學(xué)功能[20]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，變性蛋白質(zhì)在可以重新折疊的實(shí)驗(yàn)條件下可以重新折疊到原來的結(jié)構(gòu)[21]。在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)分子的多肽鏈一般都不是松散的線性分子，而是以α-螺旋、β-折疊延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的形態(tài)出現(xiàn)[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，雞大多數(shù)STAT基因主要由α-螺旋組成，其次是無規(guī)則卷曲，占比例最少的是β-折疊。

本次研究鑒定得到5個(gè)雞STAT基因家族成員。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，ChSTAT均為酸性蛋白、不穩(wěn)定蛋白且是親水蛋白；根據(jù)進(jìn)化關(guān)系可知同一分支的基因結(jié)構(gòu)以及蛋白保守結(jié)構(gòu)域較為相近；ChSTAT分布在7，27，33等3條染色體上；除ChSTAT2以外其他成員主要由α-螺旋組成。