異養硝化-好氧反硝化復合菌劑的固定化與脫氮性能研究1

孫巍，夏春雨，李長秀，林美琴，韋明肯

(廣東石油化工學院 生物與食品工程學院，廣東 茂名 525000)

固定化菌劑包埋法中，僅依靠海藻酸鈉與聚乙烯醇固定菌劑，會存在固定化小球穩定性差、漏菌等缺陷，這就需要交聯劑進一步強化固定化小球，然而交聯劑的配比在一定程度上又會影響固定化小球的成球效果和菌的活性。本研究從改進菌劑的固定化材料出發，增加適量的活性炭，增強固定化小球的機械強度，采用響應面法優化包埋載體和交聯劑的配比，確定固定化菌劑保存活性的合適配比，并驗證固定化好氧反硝化菌劑與異養硝化菌劑的脫氮性能。

1 實驗材料與方法

1.1 菌種來源

ParacoccusversutusLJ2(GDMCC NO：60338)，PseudomonasmendocinaYG8 (GDMCC NO：60340)，PseudomonasindoloxydansLJ9(GDMCC NO：60339)，以下分別簡稱為LJ2，YG8，LJ9，這三株異養硝化-好氧反硝化菌均為本實驗室分離、純化、鑒定和專利保藏的菌種，具有優良的異養硝化與好氧反硝化脫氮性能。

1.2 藥品、菌劑及培養基配方

海藻酸鈉、聚乙烯醇(型號1788)、硼酸、氯化鈣，均購自天津大茂，500 g/瓶，分析純。異養硝化菌劑復配比為m(LJ2)∶m(YG8)∶m(LJ9)=2.6∶1.1∶1.3；好氧反硝化菌劑復配比為m(LJ2)∶m(YG8)∶m(LJ9)=1.5∶1.5∶2；LB液體培養基：酵母浸膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，細菌學蛋白胨 10 g/L，pH 7.0；異養硝化培養基：(NH4)2SO40.47 g/L，(CH2COONa)2·6H2O 4.5 g/L，維氏鹽溶液50 mL/L，pH 7.0；好氧反硝化培養基[6]：KNO30.72 g/L，(CH2COONa)2·6H2O 4.5 g/L，維氏鹽溶液50 mL，pH 7.0；維氏鹽溶液：K2HPO46.54 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，MnSO4·H2O 0.04 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L。培養基所用藥品廠家與規格：酵母浸膏、細菌學蛋白胨購自北京陸橋，500 g/瓶。

1.3 菌劑的種子液制備

將LJ9、YG8、LJ2分別接種到LB培養基中進行活化，活化條件為30 ℃、150 r/min，24 h后將活化的菌懸液置于冷凍離心機里，4000 r/min離心10 min。離心后分層的菌懸液去除上層澄清液體，下層菌體用無菌水洗滌，重復以上步驟2～3次，最后將菌懸液的OD600用無菌水調至0.6～0.8后，即可作為LJ9、YG8、LJ2的種子液。

1.4 固定化小球的制備

1)固定化小球的制備。在水浴鍋中，水料比9∶1，95 ℃下溶解海藻酸鈉和聚乙烯醇，制成海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液。將活性炭先與一定量的復合菌劑混合并靜置20 min，然后將海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液倒入活性炭與復合菌劑的靜置液中；取上述混合溶液，再滴加到氯化鈣和硼酸的混合液中，使其成為固定化小球，置于4 ℃冰箱中交聯24 h后，取出置于超凈工作臺上用無菌超純水洗滌3次，4 ℃下保存于冰箱中備用。

2)固定化小球物理特性評價標準。本研究中包埋載體優化以成球性、穩定性和傳質性能這三個因素對固定化小球的物理特性做出評價，每一因素滿分為10分，固定化小球物理特性評價標準如表1所示，三者累加即為總分，滿分為30分。交聯劑優化通過成球性這一因素對其進行評分，總分為10分。

表1 固定化小球物理特性的評價標準

1.5 固定化小球包埋載體響應面優化

固定化小球包埋載體配比優化，以聚乙烯醇(C)、海藻酸鈉(B)和活性炭質量分數(A)為優化因素，響應面設計如表2所示。固定化小球物理特性得分為響應值，進行包埋載體的響應面優化實驗。

表2 響應面實驗因素和水平對照水平因素A/%B/%C/%-11180231013512

1.6 固定化小球交聯劑響應面優化

固定化小球以硼酸、氯化鈣為交聯劑，優化硼酸、氯化鈣配比和交聯劑體積，響應面設計如表3所示。固定化小球物理特性得分為響應值進行交聯劑的響應面優化實驗。

表3 響應面實驗因素和水平因素對照水平因素Y1(硼酸)/gY2(氯化鈣)/gY3(交聯劑)/mL-13180042100153120

1.7 固定化異養硝化菌劑脫氮性能研究

1.8 固定化好氧反硝化菌劑脫氮性能研究

2 實驗結果與分析

2.1 固定化小球包埋載體組成配比響應面優化

固定化小球包埋載體組成配比應用Design Expert 軟件設計，實驗結果見表4。回歸方程的方差分析及包埋載體配比對固

表4 響應面三個因素配比序號1234567891011121314151617A/%11210121020111012B/%53133333553153113C/%121010101210121010108881010128總得分/分22.026.024.026.021.026.023.027.024.024.024.523.018.022.026.018.025.0

定化效果影響的響應面分析見表5和圖1。由表5可知：包埋載體成球性的回歸模型F=7.84，P<0.01，表明這個模型的適應性極其顯著，用該模型預測包埋載體配比是可靠的。A、B的一次項系數由于P值低于0.05，說明其含量對包埋載體有極顯著影響；B和C的二次系數的P值也低于0.01，對包埋載體有極顯著影響；此外，A和B的交互作用也對包埋載體產生顯著影響。綜上所述，該模型能夠真實描述活性炭、海藻酸鈉和聚乙烯醇之間的相互作用關系，可以用該回歸方程模型確定包埋載體組成成分的最佳配比。

表5 回歸方程的方差分析

圖1 包埋載體配比對固定化效果影響的響應面分析

由表5可知，回歸方程存在一個極大值點，在這一點上可以使響應值取得最大值，響應值E為包埋載體固定化成球效果。對表4數據進行多元回歸分析，得到下列回歸方程式，從而得到包埋載體固定化成球優化配方：活性炭1%，海藻酸鈉3%，聚乙烯醇10%。

E=26.2+1.31A+1.31B-1.38AB-BC-0.79A2-2.79B2-2.41C2

2.2 固定化小球交聯劑組成配比的響應面優化

固定化小球交聯劑組成應用Design Expert 軟件設計，實驗結果如表6所示。回歸方程的方差分析以及

表6 響應面三個因素配比實驗序號1234567891011121314151617Y1/g44434434534445535Y2/g22313223231212321Y3/mL10010080100120100808080100120100100120100120100得分/分66596655558676566

交聯劑配比對固定化效果影響的響應面分析見表7和圖2。根據表7中F=11.01，P<0.01可知，該模型的適應性極其顯著，該模型預測交聯劑配比是可靠的。Y2的一次項系數P值低于0.01，說明其含量對交聯劑有極顯著影響；Y1、Y3的一次項系數P值低于0.05，說明其含量對交聯劑有顯著影響；Y2二次系數的P值也低于0.05，對交聯劑有顯著影響；此外，Y1和Y2的交互作用也對交聯劑產生極顯著影響。綜上，該模型能夠真實描述硼酸、氯化鈣和總體積之間的相互作用關系，可以用該回歸方程模型確定交聯劑組成的最佳配比。

表7 回歸方程的方差分析

響應面越陡，等高線的形狀越呈橢圓表明兩因素之間的交互作用越顯著。硼酸與氯化鈣之間的交互作用對交聯劑固定化成球效果影響如圖2a所示。硼酸和氯化鈣交互項極顯著，在氯化鈣含量保持不變的條件下，硼酸含量的增加，包埋載體固定化成球效果下降。交聯劑總體積與硼酸之間的交互作用對交聯劑固定化成球效果影響如圖2b所示。硼酸和交聯劑總體積交互項不顯著，在硼酸含量保持不變的條件下，交聯劑總體積增加，有助于固定化小球的成型。這一點也與已有的研究報道一致。氯化鈣與交聯劑總體積之間的交互作用對交聯劑固定化成球效果影響如圖2c所示。氯化鈣與交聯劑交互項不顯著，在交聯劑總體積保持一定的條件下，氯化鈣含量增加會使包埋載體固定化小球的成球效果下降。

圖2 交聯劑配比對固定化效果影響的響應面分析

2.3 固定化異養硝化菌劑脫氮性能研究

圖3 固定化異養硝化菌劑及其對照組

2.4 固定化好氧反硝化菌劑脫氮研究

圖4 好氧反硝化菌劑固定化及其對照組

3 結論與展望

本研究通過響應面法優化混合菌劑的包埋載體最佳配比為聚乙烯醇10%，海藻酸鈉3%，活性炭1%；交聯劑最佳配比為硼酸3%，氯化鈣1%，總體積為100 mL；異養硝化-好氧反硝化菌株(LJ2、YG8、LJ9)混合組成的固定化菌劑的脫氮效果較好且表現穩定。微生物固定化技術大大增強了微生物的生存能力，因此，固定化的菌劑具有較強的抗水流、抗毒害的能力，并且固定化菌劑可重復使用，減少了資源的浪費，較未固定化的游離態菌劑而言更經濟實惠，且便于運輸及使用，擁有更廣闊的市場空間與發展前景。