熱處理中八角莽草酸對鴨腿色澤的影響

吳彬彬，傅采琪，胥 偉，郭丹郡,*，賀文杰，易 陽，王宏勛

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，農產品加工教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北省農產品加工與轉化重點實驗室，湖北 武漢 430023）

肉及肉制品的色澤變化受很多因素影響，例如肉的來源、肉品的加工、運輸和貯存條件，但其根本影響因素是肉中肌紅蛋白的變化。肌紅蛋白有3種存在形式：脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OMb）、高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MMb），而這3種肌紅蛋白比例的變化會改變肉的呈色。大部分肉制品在食用前都需要經過高溫加工，熱處理會改變肉蛋白的結構與理化特性，進而對肉品質產生影響。肌紅蛋白作為主要的肌漿蛋白，在熱處理過程中發生變性，引起肉色嚴重劣變的同時還會影響其對消化酶的敏感性，降低肉的營養價值，最終對熟肉產品的保藏與銷售產生不良影響。

鹵制品在我國歷史悠久，因其風味獨特、加工品種繁多，占有廣闊市場。鹵鴨是中國鹵肉制品的代表，八角作為主要鹵制香辛料，具有抑菌、抗氧化等功效。國內外研究發現，香辛料主效成分對鹵肉重要品質——色澤有一定程度影響。Armida、Carolina及Akarpat等發現香辛料主效成分能通過抑制OMb自動氧化生成MMb，進而改善肉制品色澤。邢淑婕等將茶多酚添加至雞腿肉中，發現貯藏過程中茶多酚通過抑制雞肉中丙二醛生成以及增強總抗氧化能力，降低肌紅蛋白氧化程度，改善鹵雞腿色澤。而關于熱處理過程中八角莽草酸對鴨腿色澤影響的研究鮮見報道。因此，本實驗探究八角提取液對鴨腿色澤的影響，并初步探討熱處理過程中八角主效成分莽草酸與肌紅蛋白在不同質量比下對鹵鴨腿色澤的影響機制，以期為熱處理過程中香辛料對肉品質影響機制等相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍鴨腿 正大蛋業有限公司；牛血清蛋白（純度≥98%） 德國BioFroxx有限公司；乙醇、乙酸乙酯、Tris、甘氨酸、考馬斯亮藍、氯化鎂、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、氯化鈉、氯化鉀、乙二酸四乙酸二鈉、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、-巰基乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

F-7000型熒光分光光度計、N-500近紅外光譜儀日本日立公司；Evolation 300型紫外-可見分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司；TGL16M冷凍離心機上海安亭科學儀器廠；FA2004B分析天平 奧豪斯儀器公司；TG16WS超速離心機 湖南長沙平凡儀器儀表有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 金壇區白塔新寶儀器廠；UVS-1旋渦振蕩器 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鴨腿肌紅蛋白制備

參考馬蘭等的方法并略有改進。取5 g肉樣，切碎，加入50 mL緩沖液（3.5 mmol/L MgCl、4 mmol/L EDTA、70 mmol/L Tris，pH 7.4），1 000 r/min勻漿30 s后，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，過濾上清液，即得肌紅蛋白粗提液。

1.3.2 莽草酸的制備與測定

參考程琦等的方法并略有改進。稱取50 g經干燥粉碎的八角粉末于1 000 mL燒杯中，加入600 mL體積分數60%乙醇溶液（食用級），60 ℃超聲提取2 h后，取出靜置10 min，減壓過濾，50 ℃旋轉蒸發濃縮定容至500 mL容量瓶中，得香辛料提取液，再經凍干得到莽草酸提取物。

莽草酸檢測色譜條件：Agilient-ZOBAX C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；流速1.0 mL/min，進樣量20 μL；流動相A為乙腈，流動相B為體積分數0.5%磷酸溶液。

根據莽草酸標準曲線測定八角中莽草酸含量，莽草酸線性方程為=13 144.16-0.68，=0.999 9。本研究選取的八角莽草酸含量為0.114 1 mg/g。

1.3.3 色差測定

參照楊寧寧等和賀文杰的方法并略有改變。將八角提取液按液料比1∶25（mL/g）加入鴨腿中，鴨腿鹵制過程中每10 min進行取樣，并采用已校準的色差計測定鴨腿亮度值（*）、紅度值（*）和黃度值（*），*和*/*能客觀展示鹵鴨腿的顏色變化以及整體品質。每個樣品表面隨機測定6個點后取平均值。

1.3.4 MMb及OMb相對含量測定

參考Liu Fang等的方法并略有改動。據八角提取液添加時間點、添加量以及該時間點對應肌紅蛋白含量，制備莽草酸與肌紅蛋白質量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min分別取2 mL混合溶液以及空白組樣液，并測定其在525、545、565、572 nm波長處吸光度。以不添加莽草酸的肌紅蛋白溶液為空白組樣液。OMb及MMb相對含量分別按式（1）、（2）計算：

式中：、、分別為/、/、/。

1.3.5 分子熒光光譜測定

參考Turgut等的方法并略有改動。根據八角提取液添加時間點、提取液與鴨肉比例以及該時間點對應肌紅蛋白含量，制備莽草酸與肌紅蛋白質量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min分別取2 mL混合溶液以及空白組樣液進行熒光掃描，以不添加莽草酸的肌紅蛋白溶液為空白組樣液。熒光掃描條件：固定激發波長296 nm，發射波長270～350 nm，激發、發射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速率12 000 nm/min。

1.3.6 熱重分析

參考Kocher等的方法并略有改動。制備莽草酸與肌紅蛋白質量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴15 min，分別對各組樣液進行熱重分析，升溫范圍20～120 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.3.7 粒徑測定

參考盧巖等的方法并略有修改。將莽草酸與肌紅蛋白質量分別按照1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的比例混合，取混合樣液1.5 mL，10 000 r/min離心10 min，粒徑儀測定溫度25℃。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Nguyen等的方法并略有改動。制備莽草酸與肌紅蛋白質量比分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液，90 ℃水浴30 min，每水浴10 min取2 mL混合溶液進行紅外光譜分析，以不添加莽草酸的肌紅蛋白溶液為空白組樣液。紅外光譜測定參數：掃描范圍500～4 500 cm，信號采集模式為衰減全反射模式。

2 結果與分析

2.1 熱處理中八角提取液對鹵鴨腿色澤的影響

圖1 添加八角提取液對鹵鴨腿色澤的影響Fig. 1 Effect of anise extract on color of braised duck thigh

肉制品色澤是判斷其感官品質的最直觀指標，*和*/*共同反映鹵制品的色澤情況。由圖1可知，隨著鹵制時間延長，添加八角提取液的鹵鴨腿*、*均呈不同程度下降趨勢，說明高溫使鴨腿成熟度增大，導致鴨腿紅度及白度降低。*則隨著鹵制時間延長呈上升趨勢，說明在高溫條件下，八角主效成分逐漸遷移至鴨肉中，鴨腿黃度會逐漸增大。當鹵制40 min時，添加八角提取液的鹵鴨腿*為5.00、*/*為0.34，均高于未添加提取液組（*為3.50、*/*為0.23），說明相較于空白組，八角提取液能一定程度抑制高溫對肉制品中呈色物質（肌紅蛋白）的氧化劣變，進而維持鹵鴨腿紅度。

2.2 莽草酸與肌紅蛋白結合機制

圖2 肌紅蛋白與莽草酸結合的Benesi-Hildebrand圖Fig. 2 Benesi-Hildebrand plot for the combination of myoglobin and star aniseed shikimic acid

熱處理過程中莽草酸與肌紅蛋白結合機制是兩者質量比的選擇依據。由圖2可知，熱處理過程中，莽草酸與肌紅蛋白質量比為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250的混合溶液的1/（莽草酸質量濃度）與相對應的Δ/Δ均滿足Benesi-Hildebrand方程Δ/Δ=1+1/。上述結果說明熱處理過程中，肌紅蛋白與莽草酸能發生反應，且在該質量比條件下滿足動態結合機制。因此，本實驗選取莽草酸與肌紅纖維蛋白質量比為1∶10 000、1∶5 000、1∶2 500、1∶1 250，進行后續研究。

2.3 莽草酸對鹵鴨腿中OMb及MMb相對含量的影響

由圖3可知，與初始值相比，熱處理10、20、30 min時空白組OMb相對含量分別減少了0.31%、0.79%、11.26%，同時MMb相對含量分別增加了7.34%、3.34%、34.51%，說明高溫條件下，OMb中亞鐵離子會被逐漸氧化形成鐵離子，進而轉變成MMb，這也是肉制品色澤發生劣變的原因。然而，相同熱處理時間下，隨著莽草酸與肌紅蛋白質量比增加，OMb相對含量呈先下降后上升趨勢，MMb相對含量呈先上升后下降趨勢。因此，莽草酸可能通過抑制OMb中鐵卟啉環中亞鐵離子氧化為鐵離子進而抑制MMb生成，最終改善鹵鴨腿色澤。但是莽草酸含量過高可能會影響肌紅蛋白中的鍵合作用，進而使鐵卟啉環中亞鐵離子暴露在外部極性環境中。這與Van Ba等發現溫度對肌紅蛋白狀態影響的結果相似。

圖3 熱處理時莽草酸對OMb（A）和MMb（B）相對含量的影響Fig. 3 Effect of shikimic acid on relative contents of OMb (A) and MMb (B) during heat treatment

2.4 莽草酸對肌紅蛋白熱變性的影響

表1 莽草酸對肌紅蛋白變性溫度和熱吸收的影響Table 1 Effect of shikimic acid from star aniseed on the denaturation temperature and heat absorption capacity of myoglobin

由表1可知，隨著莽草酸與肌紅蛋白比例增大，肌紅蛋白的變性溫度、初始變性溫度呈先下降后上升趨勢，熱吸收量呈先上升后下降趨勢。當莽草酸與肌紅蛋白質量比為1∶10 000時，肌紅蛋白變性溫度及初始變性溫度最高（92.35、117.68 ℃）、熱吸收量最低（628.42 g/J）。說明莽草酸可能通過降低肌紅蛋白熱吸收量以及抑制鐵卟啉環斷裂進而避免亞鐵離子進入極性環境中與活性氧結合形成鐵離子，但莽草酸含量過高可能會導致蛋白中化學鍵受到破壞，進而更容易發生斷裂。

2.5 莽草酸對肌紅蛋白內源熒光強度的影響

圖4 熱處理時莽草酸對肌紅蛋白內源熒光強度的影響Fig. 4 Effect of shikimic acid on endogenous fluorescence intensity of myoglobin during heat treatment

分子熒光光譜法監測熱處理過程中肌紅蛋白內部色氨酸、酪氨酸降解情況以及鐵卟啉環結構變化，這些變化均是肌紅蛋白熱變性重要特征。肌紅蛋白中主要熒光物質為色氨酸和酪氨酸殘基以及血紅素鐵卟啉的Soret帶，選取296 nm作為固定激發波長，在此波長下可認為肌紅蛋白中內源熒光來自色氨酸殘基以及血紅素鐵卟啉環。如圖4所示，當熱處理30 min時，相較于空白組，肌紅蛋白在發射波長296 nm處的熒光強度均明顯增大。這說明莽草酸通過與肌紅蛋白鐵卟啉環以及色氨酸充分結合，避免鐵卟啉環、色氨酸遭到活性自由基破壞，從而防止鴨腿色澤劣變。

2.6 熱處理過程中莽草酸對肌紅蛋白粒徑的影響

圖5 熱處理時莽草酸對肌紅蛋白粒徑的影響Fig. 5 Effect of shikimic acid on myoglobin particle size during heat treatment

肌紅蛋白粒徑可以較直觀反映鹵制過程中肌紅蛋白交聯程度進而解釋高溫條件下香辛料提取物對肌紅蛋白熱變性影響。由圖5可知，當莽草與肌紅蛋白質量比為1∶5 000、熱處理30 min時，肌紅蛋白粒徑由空白組的756 nm減小為183 nm，說明莽草酸可明顯抑制蛋白質聚集進而增加蛋白質粒度分布從而維持蛋白質的穩定性，并最終使鹵鴨腿色澤達到較佳水平。這與Ince-Coskun等發現鹽離子以及高溫對乳清蛋白粒徑影響的結果相符。

2.7 莽草酸對肌紅蛋白二級結構的影響

表2 莽草酸對肌紅蛋白二級結構相對含量的影響Table 2 Effect of shikimic acid on the secondary structure of myoglobin%

由表2可知，熱處理30 min時，相較于空白組，莽草酸與肌紅蛋白質量比為1∶10 000的肌紅蛋白-螺旋相對含量增加了14.55%，無規卷曲相對含量最低（31.62%），遠低于空白組（46.61%）。由此可知，莽草酸能一定程度阻止熱處理中蛋白質-螺旋結構轉變為-折疊，進而轉變為-轉角和無規卷曲結構，從而維持蛋白整體結構穩定。因此，此時鹵鴨腿色澤達到最佳。此結果與Chen Cheng等利用近紅外光譜分析所得熱處理中肌紅蛋白二級結構變化情況相似。

3 結 論

研究八角提取液對鹵鴨腿色澤的影響，并集中于莽草酸對肌紅蛋白結構的影響以及相關機理進行探究，結果表明，八角提取液能較好地抑制高溫對鴨肉中呈色物質（肌紅蛋白）的氧化劣變，進而維持鹵鴨腿的紅度。八角主效成分莽草酸能有效抑制OMb轉變為MMb，當莽草酸與肌紅蛋白質量比為1∶10 000、熱處理30 min時，莽草酸可降低肌紅蛋白熱吸收量，并與色氨酸結合進而防止蛋白質內部結構降解，進一步探究發現莽草酸可明顯抑制蛋白質聚集進而增強蛋白質粒度分布，并較好地保持蛋白二級結構穩定性，從而維持肌紅蛋白整體結構的穩定，最終有效改善鴨腿色澤。此結果可在為熱處理中香辛料對肉制品品質影響機制等相關研究提供參考。