基于RNA-seq分析酒酒球菌SD-2a酸脅迫應答機制

劉龍祥，彭 帥，趙紅玉，袁 林，李 華,3,4，王 華,3,4,*

（1.濱州學院生物與環境工程學院，山東省黃河三角洲野生植物資源工程技術研究中心，山東 濱州 256600；2.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100；4.西北農林科技大學合陽葡萄示范站，陜西 渭南 715300）

蘋果酸乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒釀造過程中的一個重要過程。MLF通常在乙醇發酵后開始。MLF降低了總酸度，提高了葡萄酒的細菌穩定性和感官性能。MLF作為釀酒過程中最困難的控制步驟，并不總是成功。葡萄酒的一些理化性質，如高濃度乙醇或亞硫酸鹽和低pH值，可以抑制MLF過程。由于酒酒球菌（）對葡萄酒的惡劣環境條件具有良好的適應能力，因此作為MLF的主要誘導菌株。

可以在如此惡劣的葡萄酒環境中生存，說明體內一定有一種或多種機制防御脅迫因素的潛在損害。最近研究提出了多種脅迫應答機制，如細胞內外pH值平衡、細胞膜組分和流動性、氧化應激反應、DNA和蛋白質損傷修復，但應對酸脅迫的具體機制還不清楚。

RNA-seq是研究脅迫應答反應的常用方法，但只有兩項研究對進行了全轉錄組RNA-seq分析。一種檢測了3 株不同的菌株在MLF期間表型的遺傳變異，另一種聚焦于對短期酸脅迫的響應。菌株間蛋白質編碼基因的變異可達10%，因此利用合適的參考基因組進行RNA-seq分析顯得尤為重要。Sternes等的研究將轉錄組數據映射到PSU-1基因組，而本研究使用SD-2a基因組作為參考基因組，這是這項研究的特點之一。為了更全面、系統地研究的脅迫響應機制，本研究結合生理數據對轉錄組數據進行分析。

細菌脅迫應答反應的啟動是一個連續動態變化的過程，不同階段可能會啟動不同的應對反應，同一基因在不同階段可能表現出不同的行為。因此，在原研究的基礎上，延長SD-2a酸脅迫處理時間，借助生理指標進一步探究其應激反應。本研究選擇SD-2a（CGMCC 0715）菌株作為研究對象，它與商業菌株（VinifloraOenos）相比具有更高的MLF能力，并且能夠在更惡劣的脅迫條件下生存。通過正常（pH 4.8）與酸脅迫（pH 3.0）處理條件下轉錄組測序與生物信息技術分析，篩選SD-2a酸脅迫應答關鍵基因與關鍵通路，并通過理化指標檢測（細胞膜完整性、細胞膜脂肪酸組成及含量、H-ATPase活性、細胞膜流動性和胞內pH值），驗證并補充酸脅迫應答機制，旨在為酸脅迫反應機制的研究提供更多的數據支持，有助于深入系統地研究脅迫適應性機制，為葡萄酒生產過程中MLF的穩定、可控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD-2a分離自山東省煙臺市的葡萄酒，本實驗保藏。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸、三氯乙酸、纈氨霉素、尼日利亞菌素、鄰苯二醛、-巰基乙醇、硼酸、偏磷酸和四氫呋喃等試劑均為國產分析純；H-ATPase assay kit上海杰美基因醫藥科技有限公司；ATP Assay Kit、BCECF AM 上海碧云天生物技術公司；細菌RNA提取試劑盒（D6950） 美國Omega BioTek公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Premix寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀 美國Life Technologies公司；LS55熒光分光光度計 美國PE公司；Infinite M200pro全波長多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司；MS-5977E氣相色譜儀 美國Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 培養條件

將細胞置于pH 4.8的果糖-蘋果酸番茄種子（fructosmalate acid tomato broth，FMATB）培養基中28 ℃培養，在指數期（OD≈1）結束時收獲，在無菌燒瓶中混合后分成6 等份，分別接種于pH 3.0和pH 4.8（對照）的FMATB培養基中，所有實驗都在28 ℃獨立培養進行3 次。樣品分別在酸脅迫處理前（0 h）和酸脅迫或對照處理3 h后采樣。對照處理是將細胞轉移到pH 4.8的培養基中，去除離心和培養時間對實驗結果的影響。

1.3.2 RNA提取和測序

RNA提取、cDNA文庫構建、RNA測序和數據分析均按照Liu Longxiang等的方案進行。序列文庫由北京博奧生物有限公司建立并測序。

1.3.3 轉錄組數據分析

使用SD-2a基因組進行轉錄組數據的組裝。使用FastQC（Version 0.11.5）對測序質量進行評估，然后使用NGSQC（v0.4）對低質量數據進行過濾。使用HISAT2對每個樣本的clean reads進行比對。

根據Liu Longxiang等進行樣本間基因表達分析和獨立統計假設檢驗，得到表達的差異倍數（fold change，FC）、值和值（校正后的值）。以值或值進行顯著性分析。|logFC|≥1（2 倍差異）、＜0.05是區分差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）的參數。

DEG的功能注釋使用NCBI、Uniprot、ENSEMBL、基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫進行。最后，利用默認參數，通過GO和KEGG函數分析對所有DEG的主要GO和KEGG類別進行注釋。

1.3.4 轉錄組數據驗證

采用real-time PCR對RNA-seq數據進行驗證。在前人研究基礎上選擇基因進行real-time PCR（表1）。real-time PCR采用與RNA-seq相同的RNA樣本，采用Primer Premier軟件（5.0版）對引物進行篩選分析。根據、、、和的幾何均值對real-time PCR數據進行歸一化處理。real-time PCR和數據分析按照文獻[7]進行。

表1real-time PCR實驗使用引物及基因描述Table 1 Gene descriptions of primer sequences used for validation of RNA-seq results by real-time PCR

1.3.5 細胞膜完整性檢測

采用熒光染料碘化丙啶測定酸脅迫處理對細胞膜完整性的影響。收集酸脅迫處理后0、1 h和3 h的菌體細胞8 000 r/min離心3 min，去上清液，使用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）洗滌2 次，最后調整至OD為5，添加碘化丙啶染料（終質量濃度為50 μg/mL）。細胞在37 ℃孵育30 min，使用流式細胞儀進行測定，樣品以488 nm發光、630 nm熒光發射檢測。每個樣本收集20 000個細胞，使用CELLQuest程序進行處理。

1.3.6 細胞膜脂肪酸和H-ATPase測定

按照1.3.1節的方法培養細胞。在酸脅迫處理前（0 h）和酸脅迫或對照處理3 h后采樣。

采用O’Fallon等直接脂肪酸甲酯合成法提取并處理細胞脂肪酸。使用DB-WAX毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），采用氣相色譜測定脂肪酸甲酯組成。

色譜條件：初始溫度175 ℃，保溫1 min，隨后以5 ℃/min速率提高到240 ℃，然后保溫10 min。氮氣作為載氣，流速為1 mL/min，分流比為50∶1。脂肪酸甲酯通過檢索NIST 14ms數據庫進行鑒定。

H-ATPase活性根據H-ATPase檢測試劑盒進行測定。

1.3.7 細胞膜流動性和胞內pH值測定

按照1.3.1節的方法培養細胞。在酸脅迫處理前（0 h）和酸脅迫或對照處理3 h后采樣。將待測細胞調整到OD為0.6，用0.25%甲醛在37 ℃固定30 min，然后用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.25%甲醛）沖洗2 次。

采用分子間芘激振（0.1 μmol/L）法測定膜脂肪酸鏈的橫向擴散，37 ℃標記40 min，37 ℃條件下用LS55型熒光光譜儀測定。激發波長為335 nm，發射波長為373 nm（對于單體）和470 nm（對于激態分子）（分別為5 nm和5 nm狹縫）。用準分子與單體的比值（）表示橫向擴散。

膜內部脂酰鏈旋轉擴散用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）處理后的熒光各向異性表示。菌體細胞使用5 μmol/L DPH溶液37 ℃孵育1 h后，在37 ℃下用熒光分光計進行測定，激發波長為360 nm，發射波長為430 nm（狹縫寬度5 nm）。熒光偏振度（）和各向異性（）的計算參照Wu Chongde等方法。

細胞內pH值（pH）使用BCECF AM試劑測定，采用Breeuwer等的方法。

1.4 數據分析

采用Excel 對數據進行整理，繪制表格，使用SPSS statistic 20對數據進行統計學分析，使用OriginPro 8.5、TBtools v1.068進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 RNA-seq數據驗證

為研究酸脅迫處理影響最大的基因或者代謝通路，本研究將對照組（pH 4.8_0 h和pH 4.8_3 h）與酸脅迫處理組（pH 3.0_3 h）進行比較轉錄組學研究。轉錄組測序原始數據提交至NCBI Sequence Read Archive（SRA）數據庫（登錄號SAMN08102829）。

對11個基因進行real-time PCR以驗證RNA-seq數據。在不同的比較組中，11個基因的real-time PCR數據與RNA-seq數據存在顯著相關性（圖1），說明RNA-seq數據是可信的。

圖1 篩選基因的RNA-seq與real-time PCR數據對比Fig. 1 Comparison of RNA-seq and real-time PCR results for selected genes

2.2 酸脅迫對O. oeni應答影響的整體分析

為消除離心等處理對樣品的影響，分別以pH 4.8_0 h和pH 4.8_3 h為參比條件，進行轉錄組數據的分析。共發現881個DEG。DEG數目遠高于Margalef-Catala等測序數據，但低于Liu Longxiang等用酸處理SD-2a 1 h后的DEG數目。

各比較組DEG數目如圖2、3所示。其中，比較組VS1和VS2分別有644個和609個DEG，而比較組VS3有288個DEG，比較組VS3中的DEG主要是因為培養時間的延長發生的差異表達，而不是因為酸脅迫處理。這是選擇pH 4.8_0 h作為對照樣本的局限性。因此，本研究主要采用pH 4.8_3 h的樣品數據作為對照。

圖2 3個比較組共有和特有基因對比Venn圖Fig. 2 Venn diagrams showing unique and shared genes among three groups

圖3 3個比較組上調基因與下調基因統計圖Fig. 3 Up-regulated and down-regulated genes among three groups

圖4 不同處理O. oeniSD-2a中部分DEG聚類熱圖Fig. 4 Heat map obtained from hierarchical clustering analysis of partial differentially expressed genes in O. oeni SD-2a grown under different conditions

酸性脅迫處理后DEG表達模式相關性熱圖如圖4所示。平行樣本的表達圖譜聚在同一個分支上，表明平行樣本之間具有較高的相關性，說明影響DEG表達模式的關鍵因素是酸脅迫處理。

2.3 DEG分類和功能分析

由表2可知，GO富集的DEG主要屬于生物過程的范疇。所有組的大多數DEG（VS1、VS2和VS3）被發現參與代謝過程（GO：0008152）、催化活性（GO：0003824）、細胞過程（GO：0009987）、單一生物過程（GO：0044699）和結合（GO：0005488），這與Liu Longxiang等報道的DEG相似。KEGG富集結果顯示，氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜轉運和翻譯途徑對酸脅迫更為敏感，而轉運和分解代謝、萜類和多酮類代謝、其他次生代謝產物的生物合成、轉錄和信號轉導途徑變化較小（表3）。

表2 GO數據庫富集DEG總數Table 2 Total number of differentially expressed genes enriched in GO database

表3 KEGG富集到不同代謝通路的DEG總數Table 3 Total number of differentially expressed genes enriched in KEGG pathway

2.4 O. oeni SD-2a酸脅迫應答機制分析

2.4.1 阻隔H

細胞膜是抵御脅迫的重要手段，本研究測定了細胞膜完整性、脂肪酸成分和流動性等脅迫應答指標。如圖5所示，對照組（1 h和3 h）細胞膜完整性分別為96.77%和95.88%，處于較高水平，隨時間延長略有下降。處理組（1 h和3 h）細胞膜完整性分別為85.44%和83.55%，與對照組的趨勢一致。與對照組相比，處理組細胞膜完整性有所下降，但仍保持在較高水平，這保證了實驗中有足夠的活細胞響應酸脅迫處理，保證了實驗結果具有指導意義。

圖5 流式細胞術分析O. oeniSD-2a在酸脅迫和對照條件下的細胞膜完整性變化Fig. 5 Flow cytometry analysis of change in membrane integrity of O. oeni SD-2a under acid stress and control conditions

改變細胞膜的組成和流動性是應對外界因素脅迫的重要響應方式，其中細胞膜脂肪酸在調整細胞膜流動性方面起重要作用。脂肪酸的生物合成途徑的關鍵酶是乙酰輔酶a羧化酶，在酸脅迫與對照條件下表達量無顯著差異，且脂肪酸生物合成途徑中沒有富集到DEG，說明酸脅迫處理并為改變脂肪酸的生物合成。環丙烷脂肪酸是調節細胞膜流動性的關鍵物質之一，環丙烷脂肪酸合成酶（cyclopropane fatty acid synthase gene，CFA）可以催化單不飽和脂肪酸生成環丙烷脂肪酸，在實驗組和對照組中的表達量也未發生顯著變化。此前有一項研究發現，長期酸和乙醇培養的細胞中表達增加，但另一項研究發現，乙醇脅迫處理1 h后表達水平下降。這表明短時間脅迫處理并不會改變環丙烷脂肪酸含量，在長時間的脅迫處理后，環丙烷脂肪酸開始加速積累。

SD-2a在酸脅迫下芘差向異構系數（）如表4所示。與0 h相比，在實驗組和對照組處理均降低，但對照組下降水平顯著高于實驗組，與細胞膜側向擴散速率呈正比，因此說明酸脅迫條件下細胞膜側向擴散速率較高。細胞膜軸向擴散速率的變化通過測定細胞膜內脂肪酸酰基鏈的轉動擴散表示。SD-2a在酸脅迫條件下表現出較高的熒光各向異性（），熒光各向異性與細胞膜軸向擴散速率呈反比，即酸脅迫條件下細胞膜軸向擴散速率較低。因此，在酸脅迫下，SD-2a保持了較高的側向擴散速率和較低的軸向擴散速率，較高的側向擴散速率可以使細胞保持較高的膜流動性，較低的軸向擴散速率可以保證細胞內部有穩定的離子環境。

表4 酸脅迫條件下O. oeniSD-2a的生理生化數據Table 4 Physiological and biochemical data of O. oeni SD-2a subjected to acid stress

為研究酸脅迫對細胞生理影響，對細胞膜脂肪酸組分及含量進行了測定（表5）。與對照組（pH 4.8_3 h）相比，總不飽和脂肪酸和總環狀脂肪酸的含量減少，細胞膜總飽和脂肪酸的含量增加，而不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值降低。飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值作為細胞膜流動性的一個指標，目前還沒有研究測試細胞膜流動性與脂肪酸組成之間的直接關系。此外，環狀脂肪酸的合成沒有增加，這與基因表達水平的數據一致。

SD-2a的膜脂肪酸組成變化Table 5 Membrane fatty acid composition of O. oeni SD-2a subjected to acid stress表5 酸脅迫條件下O. oeni

本研究涉及肽聚糖合成途徑的基因幾乎全部被抑制，酸脅迫誘導了-丙氨酸--丙氨酸二肽酶（orf00171）催化肽聚糖的水解作用。這說明酸脅迫抑制了能量消耗過程和細胞壁的生物合成。

這些結果表明，酸脅迫處理后，環丙烷脂肪酸、胞外聚合物和構成細胞壁和細胞膜的肽聚糖的合成下調或保持不變。由此推斷，SD-2a的抗酸脅迫能力不是通過改變脂肪酸組成和細胞壁實現的。

2.4.2 外排H

緩解酸脅迫的一個重要策略是將有害化合物（H）外排的系統，其中三磷酸腺苷結合盒（ATP binding cassette transporter，ABC）轉運體發揮了重要作用。在轉錄組中與ABC轉運體相關的121個基因中，48個基因發生差異表達。

細菌可以通過H-ATPase排出H維持細胞內外pH值穩定。如表6所示，編碼FF-ATPase的基因orf00563、orf00568、orf00569、orf00570在酸脅迫處理后上調表達，說明FF-ATPase在耐酸應答中活性增加。為了證實這一點，測定酸脅迫處理后SD-2a的H-ATPase活性（表4）。酸脅迫處理1 h后，H-ATPase活性比對照組低6.7%。隨著時間的延長，酶活性有一定程度的提高，酸脅迫處理3 h后，實驗組和對照組的H-ATPase活性無顯著差異。隨著酸脅迫處理時間的延長，H-ATPase的活性逐漸增強，從而使細胞內pH值穩定在較高水平，維持細胞的正常功能。H-ATPase在SD-2a的酸脅迫反應中發揮了不可或缺的作用。

表6 在酸脅迫條件下O. oeniSD-2a部分DEGTable 6 Some genes in O. oeni SD-2a that were significantly differentially expressed under acid condition

2.4.3 中和H

另一種抵抗酸脅迫的方法是細胞質堿化。目前，細菌中提出的產堿機制有氨基酸脫羧、氨基酸脫氨酶、精氨酸脫氨酶系統、胍丁胺脫亞胺酶系統、MLF、脲酶和谷胱甘肽依賴還原系統。但由于缺少編碼相應酶的基因，如脲酶、谷氨酸脫羧酶、賴氨酸、谷氨酸、胍丁胺脫亞胺酶、胍丁胺脫亞胺酶系統等，在中未發現相關機制。

2.4.3.1 氨基酸合成和代謝

在釀酒過程中，氨基酸是許多風味成分的重要前體，如高級醇類、酯類和芳香硫醇。此外，在惡劣環境下，氨基酸在細胞生長和存活中起著重要作用。值得注意的是，酸脅迫處理3 h后，一些氨基酸的生物合成顯著增加。特別是，乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）是支鏈氨基酸生物合成過程中的第1個限速酶，其表達量增加3.8 倍。精氨酸生物合成的限速酶，精氨酸琥珀酸合成酶，也顯示出表達增加2.9 倍。有報道稱，精氨酸可以誘導脅迫相關基因的表達，如和，精氨酸也能刺激一些菌株在低pH值下的繁殖。只有少數氨基酸合成相關酶表達下降。在葡萄酒的MLF環境中，氨基酸的正常生物合成可以通過消耗游離H改善葡萄酒的品質，降低細胞內H的濃度。

乳酸菌中氨基酸的代謝主要包括轉氨作用、脫羧作用、脫氨基作用和脫硫作用。高濃度的生物胺會影響葡萄酒的口感與安全性。生物胺的合成需要氨基酸的脫羧作用，而精氨酸是許多葡萄和葡萄酒品種中含量最豐富的氨基酸。因此，對精氨酸的代謝可能導致葡萄酒質量下降。研究表明，的精氨酸代謝是通過精氨酸脫亞胺酶途徑進行的。該途徑的3種酶（精氨酸脫亞胺酶、鳥氨酸轉氨甲酰化酶和氨基甲酸激酶）均表現出與對照組相似的表達水平，保證了葡萄酒的安全生產與消費。此外，這一代謝途徑是一個產生ATP的反應，因此可以刺激的生長。

2.4.3.2 蘋果酸和檸檬酸代謝

圖6 O. oeni蘋果酸和檸檬酸主要代謝通路Fig. 6 Main pathways of malate and citrate metabolism in O. oeni

蘋果酸和檸檬酸的代謝是維持pH值穩態的重要途徑。蘋果酸的代謝主要通過MLF完成。-蘋果酸通過蘋果酸滲透酶（malate permease，MleP）的主動轉運進入細胞，然后在蘋果酸乳酸酶（malolactic enzyme，MleA）的催化下脫羧形成-乳酸。MleA的催化需要NAD和Mn作為輔助因子。在本研究中，基因表達下調（藍色），蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，）基因表達上調（紅色）（圖6）。這一現象表明在酸性條件下，更多的-蘋果酸轉化為丙酮酸，而不是-乳酸。

檸檬酸代謝始于檸檬酸的跨膜轉運，由假定的檸檬酸轉運體（MaeP和YaeP）完成。檸檬酸被檸檬酸裂解酶（citrate lyase，CitE）裂解形成草酰乙酸鹽和醋酸鹽。檸檬酸代謝誘導香氣揮發物的產生，如雙乙酰和乙氨酸（圖6）。雙乙酰形成途徑中的酶的活性不受酸條件的抑制，確保了在葡萄酒的MLF過程中風味化合物不受影響。

蘋果酸和檸檬酸的代謝消耗質子，導致細胞內pH值升高，同時產生pH值梯度和膜電位。部分ATP是由特定的ATPase利用跨膜質子動力（proton-motive force，PMF）合成的。蘋果酸鹽和檸檬酸鹽的代謝使細胞獲得所需的能量，以維持生長和pH值穩態。

2.4.4 DNA和蛋白質損傷修復

細菌在酸性環境中生存的一個主要問題是低pH值對蛋白質和DNA的潛在損害。生物體通常有能力修復DNA和蛋白質受損的有害影響，也是如此。

MMR基因在中很少被提及，其他中也未發現MMR基因和。這被認為是一種產生高水平多態性和提高環境適應性的機制。本研究在SD-2a的轉錄本中發現了20個與DNA修復相關的基因（表6），包括之前中沒有發現的。但18個基因的表達水平沒有顯著變化，其中2個基因表達顯著下調。大部分DNA修復基因正常表達可降低低pH值下的自發突變率，保證其遺傳穩定性。

除了MMR基因，特異性蛋白質的合成是應對應激的重要途徑。最值得注意的是伴侶蛋白在酸脅迫下的活化。例如，、、、、和在3 h酸休克后SD-2a中表達增加。許多應激相關蛋白表現出差異表達。其中，作為最具特征的應激蛋白是高表達的。比Liu Longxiang等報道在酸脅迫處理1 h后該基因的倍數變化要高得多。這說明在酸脅迫的早期反應和長期適應過程中都發揮了作用。

2.4.5 能量產生與消耗

部分ATP是由特定的ATPase利用跨膜PMF合成的。跨膜PMF是由質子消耗和流出產生，這是最終合成ATP的主要驅動力。此外，在本研究中，酸脅迫處理后ATPase的4個亞基（、、和）表達上調，這一結果與Liu Longxiang等的報道一致，該報道表明酸脅迫1 h后這4個亞基表達水平增加。但最近研究表明，PMF的建立主要是為了提高內部pH值，而不是為了產生能量。

糖酵解和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環是細胞最重要的能量產生方式。但在糖酵解途徑和TCA循環中富集的關鍵基因未表現出差異表達。這說明SD-2a在短期酸脅迫下不能以這種方式獲得能量。SD-2a抵御酸脅迫的能量來源可能是PMF積累，也可能是生長初期積累的ATP。

SD-2a作為兼性厭氧細菌，在酸脅迫下氨基酸代謝是SD-2a產生ATP的重要途徑。此外，氨基酸代謝在調節細胞內pH值、產生還原力、增強細胞對環境脅迫的抵抗力等方面發揮著重要作用。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、鳥氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、甘氨酸等氨基酸生物合成途徑基因表達量顯著升高。此外，天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、胱氨酸和谷氨酸代謝也被酸脅迫激活。氨基酸生物合成和代謝的激活不僅提供能量，中和H，而且為脂肪、碳水化合物和蛋白質的合成提供骨架。因此，細胞內氨基酸的積累可以有效提高細胞在酸脅迫下的存活率。

為了研究酸脅迫后細胞內能量的變化，測定了細胞內ATP。如表4所示，在酸脅迫處理前，細胞內ATP維持在較高水平。酸脅迫1 h后，ATP含量下降，這可能是SD-2a短暫的適應反應。隨著適應時間的延長，細胞內ATP明顯增加。SD-2a酸脅迫處理3 h后，實驗組ATP含量達到對照組水平。說明SD-2a能從酸性環境中獲得足夠的能量進行正常生理活動，有利于其在酸性條件下的生存。

綜合實驗結果，根據差異表達的基因和通路，繪制了酒酒球菌SD-2a酸脅迫應答反應機制示意圖（圖7）。

圖7 O. oeni SD-2a酸脅迫應答機制示意圖Fig. 7 Schematic diagram for acid stress response mechanism in O. oeni SD-2a

3 結 論

已鑒定的DEG參與了許多過程，包括與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜轉運和翻譯相關的基因。本研究共新發現了40個DEG。中DEG的鑒定為進一步的脅迫處理提供了轉錄組分析的基礎。

在酸脅迫條件下，為了合成更多ATP并將H泵出細胞，SD-2a的ATPase活性顯著增加，適宜的pH值可維持適宜的酶促反應環境。通過調節細胞膜中總不飽和脂肪酸和總環脂肪酸的含量，可以降低細胞膜的流動性，作為抵御酸脅迫的第一道屏障。細胞內TCA循環或ATPase產生的能量顯著增加，離子轉運、氨基酸代謝、DNA修復基因和伴侶蛋白的合成等有利于抗酸脅迫的能量消耗反應顯著增加。而一些不相關的能量消耗反應被抑制。此外，參與群體感應、半胱氨酸和胱硫氨酸循環、雙組分系統和乙?；^程的一些基因在本研究中也有差異表達，這表明它們可能也參與了SD-2a的酸脅迫反應。