FAD核酸適配體生物傳感器的制備及其葡萄糖檢測的應用

王 艷，王 悅，張 帥，趙 寧，辛嘉英，孫立瑞，關樺楠

（哈爾濱商業大學 食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

葡萄糖作為食品中重要的營養成分之一，其濃度對人體自身的生理活動有很大的影響。濃度過低容易導致中風或其他血管疾病，濃度過高會導致肥胖、糖尿病、腎病、心臟病和神經損傷等。人們通過控制日常膳食中葡萄糖的攝入量，降低患有相關疾病的風險極具現實意義。當前，采用將葡萄糖氧化酶修飾在電極表面制備葡萄糖生物傳感器的方法較為普遍，然而，修飾電極過程中需要對酶進行純化，使成本增加。而且生物酶本身不穩定，受溫度、濕度以及pH值等環境條件的影響下易失活，同時葡萄糖氧化酶的生產復雜且成本昂貴。因此，極大地限制該方法在生產實踐中的應用。通過將對特定靶標具有識別和結合特性的短鏈核酸（適配體）與靶分子之間的識別和結合作用轉化為靈敏的電化學的檢測信號建立的生物傳感技術簡稱為核酸適配體生物傳感器，具有性質穩定、反應靈敏、便宜且易于操作等特點，在分析檢測領域得到了廣泛關注。到目前為止，已經建立了不同的核酸適配體傳感器如用于檢測蜂蜜中四環素、魚肉和鵝肉中氯霉素、牛乳中致病菌及微量有害物質等，并且在檢測食品中酶毒素和重金屬離子具有顯著成效。查閱相關文獻，當前還沒有建立一種檢測食品中葡萄糖的核酸適配體生物傳感器。因此，本研究將為今后研發核酸適配體生物傳感器在食品檢測中的應用提供參考。

納米金（gold nanoparticles，AuNPs）是最早出現的納米材料，與其他納米材料相比，具有制備方便、性質穩定、表面易于修飾等優點。近期研究發現，AuNPs具備葡萄糖氧化酶活性，但將其直接用于催化葡萄糖的氧化存在催化活性不足，穩定性差等瓶頸問題。甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是甲烷氧化細菌分泌的一種功能性小肽，其結構中賴氨酸基團上的—SH或—NH可與單質金形成金硫鍵（Au—S）或金胺鍵（Au—NH），可將Mb強力的固定在AuNPs顆粒上，防止AuNPs發生聚集沉淀。黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）被用作某些氧化還原酶的輔助基團，能夠在生物氧化過程中傳遞氫（H）。其結構中—NH可與游離的—COOH結合形成酰胺鍵（—CONH—）；Behling等將吡咯喹啉醌通過結構中的—NH與FAD結合形成吡咯喹啉醌/FAD單層，并接合葡萄糖氧化酶制備出葡萄糖氧化酶生物傳感器。FAD中的異四氧嘧啶環作為氧化還原活性成分，容易接受和捐贈電子，在電解液和電極表面之間進行有效的電子傳遞。同時，納米粒子表面結合了FAD可以增強其對葡萄糖的捕獲活性，提高選擇性，使該核酸適配體生物傳感器響應時間縮短，靈敏度提高。

本實驗設計的機理如圖1A所示，首先，利用AuNPs顆粒大的比表面、強的吸附能力，將Mb包裹于納米顆粒上，形成穩定的Mb-AuNPs結構體；采用滴涂法將Mb-AuNPs結構體修飾于裸金電極表面。再借助Mb結構中的—COOH與FAD牢固結合（圖1B），將FAD引入Mb-AuNPs結構體上，提高對葡萄糖的識別能力。最后，利用巰基試劑中的—SH和Au形成穩定的Au—S鍵，形成由自組裝單層膜緊密包裹的有序體系，該體系比純物理吸附體系更加穩定。制備了一種價格低廉、制備簡單、靈敏度高、易于操作的新型核酸適配體生物傳感器。

圖1 生物傳感器制備機理圖（A）、Mb與FAD結合機制圖（B）Fig. 1 Mechanism of biosensor preparation (A), and Mb-FAD binding mechanism (B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛桃 市購。

甲基彎菌OB3b、NMS培養基俄羅斯科學院催化研究所；Diaion HP-20大孔樹脂 日本三菱化工公司；無水乙醇（≥99.7%） 天津富宇精細化工有限公司；氯金酸 國藥集團上海試劑公司；葡萄糖、黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（≥97%）、-巰基乙胺、硫酸、過氧化氫（30%）、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀（均為分析純） 天津市天力化學試劑有限公司；配制溶液的水均為去離子水，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

CHI630電化學工作站、金電極（=3 mm）、鉑絲電極、Ag/AgCl電極 上海辰華儀器公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；F-7000型傅里葉紅外吸收光譜儀 日本日立公司；JEM-2100F場發射高分辨透射電鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 FAD核酸適配體生物傳感器的制備

1.3.2 FAD核酸適配體生物傳感器表征

將制備好的FAD核酸適配體生物傳感器置于6 mL葡萄糖溶液（1 mmol/L葡萄糖溶液與pH 7.2～7.4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）1∶2）中進行CV法掃描（-0.2～0.6 V），掃描速率為0.05 V/s，然后結合交流阻抗法及透射電鏡對FAD核酸適配體生物傳感器進行結構表征。

1.3.3 FAD核酸適配體生物傳感器構建條件優化

1.3.3.1 Mb與AuNPs物質的量比對響應電流的影響

用滴涂法將Mb、AuNPs按1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1物質的量比配制，分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內靜置至形成薄膜。取5 mL 5 mmol/L鐵氰化鉀溶液于容器中，先采用CV法（-0.2～0.6 V）掃描激活電極，再將電極置于6 mL葡萄糖溶液中CV法進行測定 。

1.3.3.2 FAD濃度對響應電流的影響

黃素腺嘌呤二核苷酸二核苷酸二鈉鹽按1.6×10、2.0×10、2.4×10、2.8×10、3.2×10mol/L和3.6×10mol/L配制，取2 μL同其他混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內靜置至形成薄膜，再取5 mL（5 mmol/L）鐵氰化鉀溶液于底液槽中，采用CV法掃描激活電極，再將電極置于6 mL葡萄糖溶液中進行測定。

1.3.3.3 交聯劑（-巰基乙胺）濃度對響應電流的影響

用滴涂法將-巰基乙胺試劑按4.0×10、8.0×10、12.0×10、16.0×10、20.0×10mol/L和24.0×10mol/L濃度配制，同其他混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內靜置至形成薄膜，再取5 mL鐵氰化鉀溶液于底液槽中，采用CV法掃描激活電極，再將電極置于6 mL葡萄糖溶液中進行測定。

1.3.3.4 構建時間對響應電流的影響

用滴涂法將上述混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內分別靜置4、6、8、10、12 h和14 h。取出電極CV法（-0.2～0.6 V）分別在鐵氰化鉀溶液和葡萄糖溶液進行掃描測定。

1.3.4 FAD核酸適配體生物傳感器檢測葡萄糖性能

1.3.4.1 檢測溫度對葡萄糖檢測響應的影響

用滴涂法將3 μL-巰基乙胺、2 μL FAD同Mb、AuNPs混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內靜置至形成薄膜。將6 mL葡萄糖溶液放置于15、20、25、30、35 ℃和40 ℃水浴鍋中加熱2～3 min后取出。將電極置于該體系CV法進行測定，考察溫度對葡萄糖體系檢測的影響。

1.3.4.2 緩沖溶液pH值對葡萄糖檢測響應的影響

用滴涂法將3 μL-巰基乙胺、2 μL FAD同Mb、AuNPs混合溶液分別滴涂在打磨好的金電極上，冰箱內靜置至形成薄膜。配制pH 6.4、6.8、7.2、7.4、7.8的PBS，與1 mmol/L葡萄糖溶液1∶2混合后用于測定。將模擬酶電極置于該體系CV法（-0.2～0.6 V）進行測定，考察不同pH值的PBS對葡萄糖檢測體系的影響。

1.3.5 模擬葡萄糖氧化酶特性

在最適質量濃度、修飾時間、檢測溫度下將制備好的核酸適配體生物傳感器，放入5 mL鐵氰化鉀溶液于底液槽中，采用CV法（-0.2～0.6 V）掃描激活電極，再將其置于葡萄糖溶液進行CV法測定。結合時間-電流曲線法在恒定的電壓下每隔20 s連續向0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.2）中加入0、10、50、100、200 μmol/L的葡萄糖進行表征。

1.3.6 實際樣品檢測

樣品（毛桃）的預處理：毛桃去皮去核，切成小塊裝入榨汁機中，加入30 mL去離子水，榨成均勻液態，然后用布氏漏斗過濾2 次，再轉移至100 mL容量瓶定容，混勻后用0.45 μm的濾膜過濾1 次，最后轉移至100 mL容量瓶中待用。加入不同濃度的葡萄糖標準液，重復測定3 次，考察檢測體系的加標回收率，并評價檢測體系的精確度和重復性。

1.4 數據處理

每組數據均重復3 次，利用Origin 8.0軟件處理數據作圖，采用Excel 2016軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 FAD核酸適配體生物傳感器的構建機制

2.1.1 FAD核酸適配體生物傳感器的光譜分析

圖2 AuNPs中加入Mb及FAD的紫外-可見掃描圖譜（A）、AuNPs表面修飾Mb前后以及Mb-AuNPs結合FAD后的傅里葉變換紅外光譜（B）Fig. 2 UV-visible spectra of AuNPs with Mb and FAD (A), and Fourier transform infrared spectra (B) of AuNPs before and after surface modification with Mb and Mb-AuNPs-FAD

首先在200～800 nm波長范圍內對AuNPs中逐漸加入Mb及FAD過程進行紫外-可見分光光度計檢測。如圖2A所示，Mb在282、340 nm和394 nm處出現3個特征峰。檸檬酸鈉法制備的AuNPs溶膠在520 nm左右出現一個特征峰，此峰為AuNPs粒子的共振吸收峰。向AuNPs中添加Mb，Mb分子中二硫醚S與Au具有強相互作用力，形成穩定的Mb-AuNPs結構體。修飾Mb前后AuNPs的特征峰位置未發生改變，但520 nm處的吸光度降低；同時282、340 nm和394 nm處的吸光度也顯著下降，證實Mb已經吸附在AuNPs粒子表面。向體系中加入FAD后，放置3～4 min測定。520 nm處的吸光度繼續下降，而340、394 nm處的吸光度顯著升高并趨于穩定，說明吸附在AuNPs粒子表面的Mb通過—CONH—與FAD結合；并且FAD可激活Mb部分活性位點。

在500～4 000 cm范圍內對AuNPs、Mb-AuNPs及Mb-AuNPs-FAD分別進行紅外光譜檢測。如圖2B所示，曲線b是檸檬酸鈉法制備的AuNPs溶膠的紅外光譜圖，曲線a是經Mb修飾AuNPs的紅外光譜圖在3 430、1 671、1 022 cm和539 cm的振動帶，均能證實Mb分子的存在。3 430 cm帶是由酰胺II的N—H和氫鍵伸縮振動引起。1 676 cm振動帶是羧基和酰胺基C＝O伸縮振動的結果。1 022 cm和539 cm處的譜帶是通過C—S和S—S伸縮振動產生，C—N拉伸振動引起1 385 cm周圍的振動譜帶發生變化。Mb與AuNPs結合后，位于539 cm處的S—S伸縮振動和1 676 cm處酰胺I帶峰減弱。表明Mb內的二硫醚與Au存在較強的相互作用，通過形成Au—S鍵與AuNPs粒子結合。曲線c是向Mb修飾的AuNPs中加入FAD的紅外光譜圖，隨著FAD的加入，在1 700～1 640 cm的范圍內顯示C＝O基團的伸縮振動帶。在3 475～3 150 cm范圍內觀察到N—H的伸縮振動。在3 100 cm和1 290 cm左右的地方出現酰胺基（—CONH—）的特征吸收峰。該結果與圖3紫外光譜結果一致，可清晰地表明FAD結構中的—NH已成功地與Mb中的—COOH形成穩定的酰胺鍵，并結合到納米粒子的表面上，使得其表面電子轉移速率增強。

2.1.2 FAD核酸適配體生物傳感器的透射電鏡分析

圖3 AuNPs（A）、Mb-AuNPs（B）和Mb-AuNPs-FAD（C）的透射電鏡Fig. 3 Transmission electron microscopic images of AuNPs (A),Mb-AuNPs (B) and Mb-AuNPs-FAD (C)

透射電鏡下觀察，AuNPs顆粒（圖3A）粒子分散性較好，呈圓球形，形態分布均一。當AuNPs與Mb結合形成Mb-AuNPs結構體后（圖3B），Mb阻止了AuNPs顆粒之間的團聚，改善了顆粒的分散性，但顆粒之間的間距均勻性欠佳。當FAD通過與Mb結構中的—COOH與Mb緊密結合（圖3C），AuNPs顆粒的分散性進一步增強可使其催化活性增加，且顆粒分布的均勻性得到顯著改善。

2.1.3 FAD核酸適配體生物傳感器的電化學分析

圖4 不同生物傳感器在電解液體系的交流阻抗圖（A）及在葡萄糖體系的循環伏安圖（B）Fig. 4 AC impedance plot of different biosensors in the electrolyte system (A) and cyclic voltammogram in the glucose-sugar system (B)

交流阻抗譜法可以更加深入地研究電極電阻的變化，阻抗圖中圓弧半徑越大表明電極表面阻抗值增大。電極的阻抗值隨著每一種物質的加入而增大，表明材料已經成功的修飾在電極上。由于裸金電極不與電解液發生氧化還原反應，如圖4A曲線d所示，交流阻抗曲線幾乎為一條直線。帶有負電的AuNPs粒子與不帶電的裸金電極接觸形成Au—Au鍵，通過靜電吸附力AuNPs被吸引、貼附在裸金電極表面。如圖4A曲線a電極表面電流阻抗值也隨之發生變化，說明其異向電子阻礙作用較小。修飾在電極表面的AuNPs可以催化體系中的葡萄糖發生氧化反應，因而產生一對較強的氧化還原峰如圖4B曲線b（=0.307 4 V，=4.02 μA；=0.222 0 V，=-2.124 μA）。

將Mb滴加在金電極表面，AuNPs表面的空隙進一步減少，Fe(CN)轉移到電極表面受到的阻力增大。如圖4A曲線b表明電極表面阻抗值增大，說明Mb已經緊密吸附在AuNPs粒子表面。由于Mb不具有氧化酶（催化）活性，單獨修飾在金電極表面，電極上無氧化還原物質產生，如圖4B曲線d表示Mb在反應體系中不發生氧化還原反應。將Mb與AuNPs混合修飾在金電極表面，固定在AuNPs顆粒上的Mb會降低納米粒子傳輸電子及催化葡萄糖氧化的能力，如圖4B曲線c氧化還原峰電流稍微降低（=2.251 μA；=-1.821 μA）。FAD通過結構中的—NH與Mb中的—COOH形成穩定的酰胺鍵，修飾在金電極表面，如圖4A曲線c阻抗值明顯增大證明該體系不斷形成更加致密的自主裝膜，使電極表面與電解液的電子傳輸阻礙加劇。由于FAD可以在溶液和電極表面傳輸電子，進一步催化葡萄糖反應；如圖4B曲線a氧化還原峰電流都明顯的增加（=0.307 V，=5.621 μA；=0.246 V，=-1.885 μA）；該核酸適配體生物傳感器的葡萄糖氧化酶活性顯著提高，證實FAD可加速體系中葡萄糖氧化。

2.2 FAD核酸適配體生物傳感器的優化

2.2.1 Mb-AuNPs物質的量比對響應電流的影響

圖5 Mb-AuNPs物質的量比與響應電流的關系Fig. 5 Relationship between molar ratio of Mb to AuNPs and response current

Mb-AuNPs物質的量比決定模擬葡萄糖氧化酶催化活性及核酸適配體生物傳感器穩定性好壞。如圖5所示，當Mb-AuNPs物質的量比為1∶2、2∶3和1∶4時，氧化峰的響應電流值降低?？赡苁谴罅康腁uNPs易發生粒子團聚現象阻礙電流傳遞，導致生物傳感器催化性能降低，當Mb-AuNPs物質的量比為4∶1時，由于AuNPs表面被大量的Mb緊密包圍，AuNPs粒子的催化活性位點減少，并且Mb本身不具備傳遞電子的作用，導致FAD核酸適配體生物傳感器模擬酶葡萄糖氧化酶的活性降低，氧化還原峰的響應電流值到達最低。因此，本實驗選擇1∶1為Mb、AuNPs的最佳物質的量比。

2.2.2 FAD濃度對響應電流的影響

圖6 FAD濃度與響應電流的關系Fig. 6 Relationship between response current and FAD concentration

FAD在核酸適配體生物傳感器催化葡萄糖反應過程充當氧化還原的電子載體，主要起到傳遞氫的作用。本實驗考察1.6×10～3.6×10mol/L FAD構建的FAD核酸適配體生物傳感器，并在1 mmol/L的葡萄糖溶液中檢測響應電流。如圖6所示，當FAD濃度在1.6×10～3.6×10mol/L時，氧化峰電流值持續上升，適量的FAD可以增強其對葡萄糖的捕獲活性，提高選擇性，使生物傳感器響應時間縮短，靈敏度提高。FAD濃度過高其Mb結合位點接近飽和，造成浪費；同時在2.4×10～3.6×10mol/L范圍內，體系反應速率變緩，基本已經達到最優的反應效果。因此，本實驗選擇2.4×10mol/L為FAD的最佳濃度。

2.2.3-巰基乙胺濃度對響應電流的影響

圖7 交聯劑濃度與響應電流的關系Fig. 7 Relationship between concentration of cross-linker and response current

以交聯劑-巰基乙胺作為Mb-AuNPs結構體負載在金電極上的黏結劑，它起到防止Mb-AuNPs結構體泄露的作用。本實驗考察0.004～0.024 mol/L的-巰基乙胺構建的核酸適配體生物傳感器，并在1 mmol/L葡萄糖溶液中檢測響應電流。如圖7所示，-巰基乙胺濃度在0.004～0.012 mol/L時，氧化峰響應電流值逐漸升高。適量的-巰基乙胺可以有效調整Mb-AuNPs結構體在裸金電極表面的空間分布，使得Mb-AuNPs結構體擁有更好的分布密度和取向。當-巰基乙胺濃度在0.012～0.024 mol/L時，氧化峰響應電流值緩慢降低。-巰基乙胺本身不導電，過量的巰基乙胺會影響金電極的導電性，進而影響Mb-AuNPs-FAD結構體在電極表面表達生物活性，導致核酸適配體生物傳感器催化性能降低，因此，本實驗選擇0.012 mol/L-巰基乙胺為交聯劑濃度。

2.2.4 構建時間對響應電流的影響

圖8 生物傳感器構建時間與響應電流的關系Fig. 8 Relationship between biosensor construction time and response current

影響生物傳感器催化性能的關鍵因素是構建時間。本實驗考察0～14 h，核酸適配體生物傳感器在電解液及葡萄糖體系中響應電流的變化情況。如圖8所示，在電解液體系中構建時間在4～8 h氧化峰電流值呈下降趨勢，8～14 h氧化峰電流值緩慢下降。構建時間為8 h時，氧化峰電流達到最低值。在葡萄糖體系中構建時間在4～8 h氧化峰電流值成上升趨勢，8～14 h氧化峰電流值緩慢上升。構建時間為8 h時，氧化峰電流達到最高值。結果表明：構建時間過短時，交聯劑和Mb-AuNPs-FAD結構體形成的薄膜未能與電極表面緊密貼合，催化葡萄糖反應過程中易脫落。構建時間過長時，AuNPs和Mb在空氣中長時間暴露易被氧化導致Mb-AuNPs結構體生物活性降低。當構建時間為8 h時，檢測體系反應效果基本達到最優，因此本實驗選擇8 h為FAD核酸適配體生物傳感器最優的構建時間。

2.3 檢測參數對核酸適配體生物傳感器性能的影響

圖9 檢測溫度（A）、緩沖溶液pH值（B）與響應電流的關系Fig. 9 Relationship between detection temperature (A), buffer solution pH (B) and response current

如圖9A所示，考察15～40 ℃不同溫度與氧化峰響應電流的關系。溫度由15 ℃上升至25 ℃時，FAD核酸適配體生物傳感器催化葡萄糖反應的速率加快，該溫度段氧化峰響應電流升高，在25 ℃時，響應電流值達到最高值。表明在15～25 ℃范圍內，FAD核酸適配體生物傳感器模擬葡萄糖氧化酶活性具有較好的催化效果。溫度由25 ℃繼續升高至40 ℃，氧化峰響應電流逐漸降低，推測可能持續的高溫導致Mb活性降低從AuNPs表面脫落，從而使FAD結合量減少，導致核酸適配體生物傳感器對葡萄糖的捕獲活性活性降低。考慮到核酸適配體生物傳感器其實用性，反應溫度過高不利于對實際樣品檢測，同時在20～25 ℃范圍內，體系反應速率變緩，基本已經達到最優的反應效果，本實驗選擇25 ℃為最佳檢測溫度。

為了優化核酸適配體生物傳感器的催化性能，對檢測體系的pH值進行了優化，分別為pH 6.4、6.8、7.2、7.4和7.8。如圖9B所示，pH 6.4～6.8時，AuNPs在酸性條件下粒徑變大催化活性降低，間接影響核酸適配體生物傳感器的檢出限、靈敏度等。pH 7.4～7.8時，氧化峰電流迅速下降，推測在堿性條件下，Mb易失活從電極表面脫落，導致FAD結合量減少，FAD核酸適配體生物傳感器的模擬葡萄糖氧化酶的活性降低。當pH 7.2時，氧化峰電流值達到最高，FAD核酸適配體生物傳感器對葡萄糖的檢測效果最佳，更符合實驗所需pH值條件。

2.4 模擬葡萄糖氧化酶特性

2.4.1 循環伏安法分析

圖10 FAD核酸適配體生物傳感器在葡萄糖溶液體系中的循環伏安圖Fig. 10 Cyclic voltammogram of FAD aptamer-based biosensor in glucose solution

在優化實驗條件下，向5 mL 0.1 mol/L PBS中加入不同濃度葡萄糖，CV法進行測定。循環伏安曲線隨著不同濃度葡萄糖溶液的加入出現顯著變化，如圖10所示，氧化峰電流由1.926 μA增加到5.662 μA，氧化峰電位由0.289 V增加到0.298 V。還原峰電流由-1.592 μA增加到-4.866 μA，還原峰電位由0.244 V增加到0.266 V。結果表明，FAD核酸適配體生物傳感器在葡萄糖體系中對葡萄糖有明顯的響應信號。在10～200 μmol/L時葡萄糖濃度與氧化峰電流之間呈現良好的線性關系。

2.4.2 時間電流法分析

圖11 FAD核酸適配體生物傳感器對葡萄糖的時間電流響應（0.1 mol/L PBS，pH 7.2）Fig. 11 Time-current response of FAD aptamer-based biosensor to glucose (in 0.1 mol/L PBS at pH 7.2)

在優化體系條件下，每隔20 s連續向0.1 mol/L PBS溶液（pH 7.2）中加入0、10、50、100、200 μmol/L的葡萄糖，采用時間電流法進行測定?？疾霧AD核酸適配體生物傳感器對葡萄糖的電流響應，結果如圖11所示，該傳感器還原峰值隨著葡萄糖濃度的增加逐漸遞增。葡萄糖在10～200 μmol/L濃度范圍內與該核酸適配體生物傳感器的響應電流呈良好的線性關系=0.485 8+0.015 29，相關系數=0.997 91，檢出限為4.22×10mol/L，與圖10循環伏安法結果一致。與之前的AuNPs催化葡萄糖檢測方法相比具有顯著優勢。

2.5 穩定性、重復性實驗結果

使用同一根FAD核酸適配體生物傳感器測定葡萄糖樣品溶液，重復測定5 d。如圖12所示，平均峰電流為4.027 μA，相對標準偏差為0.45%，表明該核酸適配體生物傳感器的重復性良好。再將制備好的電極在冰箱中放置7 d，然后進行檢測。氧化峰電流為3.447 μA，與第5天的酶電極峰電流相比無顯著差異（＞0.05），表明該核酸適配體生物傳感器的穩定性良好，使用壽命長，可以進行實際應用。

圖12 重復性實驗結果Fig. 12 Results of repeatability test

2.6 實際樣品檢測結果

表1 毛桃樣品中不同濃度葡萄糖含量的回收率Table 1 Recoveries of different concentrations of glucose in spiked actual samples

對4 只試管內葡萄糖含量進行測定，結果如表1所示。FAD核酸適配體生物傳感器在其所允許的誤差范圍內，對毛桃中葡萄糖含量的加標回收率均在94%～101%之間，相對標準偏差在1.75%～2.25%之間。表明該核酸適配體生物傳感器檢測體系準確可靠，具有良好的精確度和重復性。

3 結 論

利用AuNPs顆粒較強的吸附能力，將Mb包裹于納米顆粒上，形成穩定的Mb-AuNPs結構體。采用滴涂法將Mb-AuNPs結構體修飾于裸金電極表面，借助Mb結構中的—COOH與FAD牢固結合，再將FAD引入Mb-AuNPs結構體上，提高對葡萄糖的識別能力，從而構建具備葡萄糖氧化酶活性的新型核酸適配體生物傳感器。通過循環伏安法及時間-電流曲線法探討了其應用于葡萄糖檢測的可行性。研究結果顯示，核酸適配體生物傳感器最佳構建時間為8 h，Mb與AuNPs最佳物質的量比為1∶1，FAD最佳濃度為2.4×10mol/L，巰基試劑濃度為0.012 mol/L。在25.0 ℃、pH 7.2時，葡萄糖濃度在10～200 μmol/L與該核酸適配體生物傳感器的響應電流呈現良好的線性關系為0.997 91。新型核酸適配體生物傳感器檢出限為4.22×10mol/L，相對標準偏差為0.45%，具有制備簡單，檢測效果靈敏，使用壽命長，穩定性良好等特點。本研究將為今后核酸適配體生物傳感器在食品檢測中的應用提供參考。