屠宰過程中豬胴體表面及環境的細菌菌相分析

唐 林，郭柯宇，賴鯨慧，李建龍，李 琴，楊 勇，鄒立扣，劉書亮,3,*

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川農業大學資源學院，四川 成都 611130；3.四川農業大學食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014）

豬肉是我國主要的肉類食品之一，2019年全球豬肉消費量達到1.009億 t，其中我國豬肉消費量（4 486.6萬 t）約占全球豬肉消費量的49%，即使受到非洲豬瘟和新冠肺炎疫情的影響，我國豬肉消費量在全球范圍內仍處于絕對領先的地位。然而，從生豬到餐桌供應鏈的微生物安全卻存在風險。生豬體表帶有大量塵埃、雜質以及病菌等，刺殺放血、燙毛、開膛劈半、去內臟等環節都容易造成豬肉中微生物增加，并且許多食源性致病菌主要存在于豬的呼吸道和胃腸道中，商業屠宰期間的燒灼過程并不能消除這些細菌，清洗反而會使這些細菌污染整個胴體。分割過程由于肉塊與外界的接觸面變大也容易造成嚴重的交叉污染。因此，調查屠宰分割過程中豬胴體表面的微生物污染情況，找出關鍵污染環節并加以控制，對減少豬胴體的交叉污染和提高企業經濟效益非常重要。

肉類微生物的研究方法主要有傳統培養和分子生物學技術。傳統培養方法操作簡單、能較直觀地反映微生物數量，但由于選擇性生長、營養條件等限制，無法完整反映樣品的菌相組成。高通量測序（highthroughput sequencing，HTS）技術針對樣本中細菌16S rRNA、真菌18S rRNA或ITS特定區域進行擴增，克服了偏向培養和及時DNA克隆的限制，能夠同時分析多個樣品，也能夠深入描述樣本微生物群落組成和相對豐度，已廣泛應用于微生物多樣性與群落結構組成研究。盡管傳統培養方法顯示出一些缺點，但在分離、鑒定食品腐敗微生物時仍必不可少。Illikoud等通過傳統培養方法從變質食品及屠宰場環境中分離出161 株熱死環絲菌并進行鑒定。Zhao Shengming等通過總活菌數、假單胞菌數、熱死環絲菌數和腸桿菌科數等確定豬肉變質程度，以及不同保鮮劑對冷卻豬肉的保鮮效果。通常認為，活菌計數達到7～8（lg（CFU/g））會導致肉的微生物腐敗，但這僅具有參考價值，因為計數時包括潛在的保護性細菌，分析食品的腐敗還需要評估到屬、種水平。因此，在實際應用中多采用傳統培養與HTS相結合的方法分析樣本菌相。Yang Chao等分別通過傳統培養計數和HTS技術研究經防腐劑處理后在4 ℃貯存期間豬肉細菌數和優勢菌群結構的變化。Li Xinfu等通過HTS監測真空包裝臘肉在冷藏過程中的微生物組成和種群動態變化，并通過傳統培養方法對特定腐敗微生物進行分離鑒定，明確了造成臘肉腐敗的主要微生物。Cauchie等對不同來源和貯存條件的288 份豬肉末樣品進行16S rRNA擴增子測序與耐冷菌、乳酸菌計數，發現組合方法在豬肉碎樣品的微生物動力學分析方面提供了互補結果。Peruzy等對豬肉糜中微生物群落的分析結果也表明，使用16S rDNA測序進行分離株鑒定以及16S rRNA擴增子測序分析整體群落可以提供互補結果。因此，HTS技術與傳統培養方法相結合，可以更詳細地解析肉類環境中微生物的群落組成及其復雜關系。

本實驗通過傳統培養方法和HTS技術相結合分析生豬屠宰鏈不同環節豬胴體表面的微生物污染情況，測定屠宰車間刀具和分割車間各接觸面細菌菌落總數，確定屠宰分割過程中的關鍵污染環節，以期為減少屠宰分割過程中豬胴體的交叉污染和提高豬肉出庫時的微生物安全性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川某豬屠宰加工廠生產鏈中豬胴體表面、刀具及環境接觸面的擦拭樣品。

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bole agar，VRBA）培養基 杭州微生物試劑有限公司；MRS、CFC選擇培養基、假單胞菌CFC選擇培養基添加劑、STAA培養基、STAA添加劑、煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯 青島海博生物技術有限公司；Gengreen核酸染料、2×PCR MasterMix、DNA Marker DL15000 天根生化科技（北京）有限公司；細菌DNA提取試劑盒 美國Omega公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司。

1.2 儀器與設備

PowerPac Basic型凝膠電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；JX-25B手提式高壓滅菌鍋寧波久興醫療器械有限公司；DHG-9162電熱恒溫培養箱上海一恒科技有限公司；ST 16R冷凍離心機 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 刀具和接觸面取樣

分別于生豬屠宰分割前期、中期和后期進行刀具和接觸面取樣。屠宰車間刀具包括刺殺放血、去頭、開膛、劈半和修剪用刀具；分割車間接觸面包括傳送帶、案板、肉框、刀具和操作人員手部。傳送帶、案板、肉框等接觸面具體取樣方法如下：采用100 cm取樣器，隨機選取3個點，共擦拭300 cm，剪下棉頭放入含30 mL滅菌生理鹽水的無菌采樣袋中。刀具和操作人員手部采用25 cm取樣器，隨機選取4個點，共擦拭100 cm，剪下棉頭裝入含10 mL滅菌生理鹽水的無菌采樣袋中，作為原液于低溫狀態下送回實驗室計數。將細菌原液以10 倍遞增稀釋成合適梯度進行微生物總數測定，每個稀釋度做2個平行。重復取樣3 次。

1.3.2 豬胴體表面取樣

采用跟蹤取樣法，分別于刺殺放血（FX）、脫毛（TM）、開膛去臟（KT）、沖淋（CL）、冷卻排酸（LQ）和分割（FG）后進行取樣。除分割外，其余各環節隨機選取3個豬胴體，每個胴體選取頸部、肩部、胸口部、背部和腿部5個部位，每個部位擦拭100 cm，共擦拭1 500 cm，然后剪下棉拭子放入裝有150 mL無菌生理鹽水的無菌采樣袋中。分割后的采樣包含前腿肉、后腿肉、里脊肉、肋排和五花肉5個部位，每個樣品各部位隨機選取3 塊肉擦拭，擦拭方法與上述一致。將采集的樣品原液分成兩份，一份用于HTS，另一份梯度稀釋后用于微生物計數。

1.3.3 微生物計數

菌落總數測定參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》；大腸菌群測定參考GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》第二法，大腸菌群的平板計數法；乳酸菌數測定參考GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》；假單胞菌數測定參考SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計數方法》；熱死環絲菌數測定參考傅鵬等的方法。計數所用選擇性培養基和培養條件如表1所示。

表1 不同種類微生物的培養方法和條件Table 1 Cultivation methods and conditions for different groups of bacteria

1.3.4 HTS分析

1.3.4.1 DNA提取及PCR擴增

參考夏小龍的方法進行樣品處理。取50 mL細菌原液2 000 r/min離心3 min，去除底部雜質，上清液于12 000 r/min離心10 min得菌體沉淀。收集的菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，離心，然后將沉淀分裝于3個2 mL無菌EP管中，-20 ℃保存。

采用細菌DNA提取試劑盒進行樣品DNA提取，提取的DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后委托上海美吉生物醫藥公司進行MiSeq平臺測序分析。

1.3.4.2 測序數據處理及生物信息學分析

將測序得到的Raw Date經過Fastp（V0.19.6）和Flash（V1.2.11）進行質控、拼接和過濾，采用Uparse軟件（V7.0.1090）按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，得到OTU的代表序列以SILVA（Release138 http://www.arb-silva.de）數據庫為基礎，通過RDP Classifier（V 2.2，置信度閾值為0.7）進行分類學分析。通過Qiime平臺（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）進行多樣性分析，包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數和覆蓋率，并利用R語言工具繪制樣品稀釋曲線、群落柱形圖和群落熱圖，統計不同樣品在門和屬水平上的組成差異。

1.4 數據處理

采用Excel 2016和Origin 2019b軟件進行數據處理及繪圖，采用SPSS 21.0軟件進行差異顯著性分析（＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 基于傳統培養方法的微生物數量

2.1.1 刀具及各接觸面污染的微生物情況

圖1 屠宰分割車間刀具及接觸面細菌菌落總數Fig. 1 Total number of bacterial colonies on the knives and contact surfaces in slaughter and segmentation workshops

由圖1可知，屠宰車間各環節劈半刀具菌落總數較低（平均為4.49（lg（CFU/cm）），修剪刀具菌落總數較高（平均為5.21（lg（CFU/cm））），這可能是由于劈半刀具與豬胴體表面接觸較少，且未與內臟接觸，而修剪刀具主要修剪頸部淋巴等，頸部處于倒掛胴體的最下端從而導致污染嚴重。與屠宰前、后期相比，屠宰中期各環節刀具的污染均最為嚴重，且差異不顯著（＞0.05），其次是屠宰后期。這是因為屠宰中期結束后會對刀具進行清水沖洗，說明定期清洗刀具能有效清除殘留的血跡和組織，減少刀具表面的微生物附著。

分割車間各接觸面的污染整體高于屠宰車間刀具，這與劉壽春等的研究結果一致。傳送帶和肉框的污染較嚴重，菌落總數平均值分別達6.34（lg（CFU/cm））和6.25（lg（CFU/cm）），這是因為潮濕的設備表面沾染了肉塊碎屑和液體從而導致有氧菌大量增殖。其次是操作人員手部、案板和刀具，菌落總數平均值分別為6.08、5.94、5.93（lg（CFU/cm）），處于較高水平。NY/T 632—2002《冷卻豬肉》規定冷卻胴體應在良好操作規范和良好衛生條件下分割，刀具、箱框和工作人員手部應每隔1 h消毒1 次，可能與該企業未嚴格執行有關。同時，加工設備中的微生物也常在分割和低溫貯藏的肉中發現，它們是導致肉類變質的主要因素，這說明加工環境及接觸設備的潔凈程度直接影響冷卻豬肉的初始微生物水平。為最大限度地減少設備對屠體的微生物污染，監管機構要求屠宰場提供80 ℃以上熱水以凈化刀具和其他器皿，但部分企業并未嚴格執行；并且應該注意的是，熱水浸泡時間的長短以及水中浮渣和沉淀量均對去污效果非常重要。已有研究表明，要消滅沙門氏菌需在82 ℃水中浸泡10～20 s。此外，許多肉類加工廠的傳送帶由鉸鏈塑料段構成，常規清潔往往無法清除其中所有的肉屑，細菌不可避免地在其中生長，從而造成嚴重的交叉污染。

2.1.2 豬胴體表面污染微生物情況

圖2 屠宰分割過程中豬胴體表面微生物污染情況Fig. 2 Microbial contamination on the surface of pig carcasses during slaughter and segmentation

由圖2可知，不同屠宰階段胴體表面的微生物數量存在差異，但整體變化趨勢大致相同：脫毛、開膛、沖淋以及預冷后胴體表面的各類微生物數量逐漸減少，分割后有所上升，這與趙慧等的研究結果一致。Mann等的研究也得出類似結論，即細菌污染主要發生在豬屠宰的脫毛和胴體分割過程。2073/2005/EC《食品微生物標準》中規定豬胴體菌落總數的滿意水平為4.0（lg（CFU/cm）），可接受水平為5.0（lg（CFU/cm）），基于此發現，本研究中菌落總數在開膛、沖淋和預冷后達到可接受水平，分別為4.83、4.21（lg（CFU/cm））和3.90（lg（CFU/cm））；但分割環節加重了胴體的污染，菌落總數達到5.76（lg（CFU/cm）），超出可接受水平，這是由于分割過程肉塊與工人手部、刀具、傳送帶和肉框等接觸，屠宰機械和分割設備表面的微生物對肉塊造成了污染；還可能是因為分割車間溫度（10～12 ℃）高于冷卻排酸間溫度（0～4 ℃）使得嗜冷微生物繁殖所致。此外，胴體表面的乳酸菌數量始終較高，平均數量為3.97（lg（CFU/cm）），其次是假單胞菌、大腸菌群和熱死環絲菌，平均數量分別為2.42、2.18（lg（CFU/cm））和2.04（lg（CFU/cm））。

2.2 基于HTS分析豬胴體表面細菌菌群多樣性

2.2.1 測序數據統計

對原始數據進行拼接、質控和過濾，最終得到881 458個有效序列，平均長度為427 bp，產生93～624個OTU。如圖3所示，當樣品測定序列數超過28 000時所有樣品的稀釋曲線均趨于平坦，說明已包含大部分多樣性信息，測序深度足夠。

圖3 屠宰分割過程中豬胴體表面微生物的Sobs稀釋曲線Fig. 3 Sobs rarefaction curves for the microbes on pig carcass surface during slaughter and segmentation

2.2.2多樣性指數分析

如表2所示，放血和脫毛環節的Chao1、ACE和Shannon指數明顯高于其他環節，屠宰分割過程中群落多樣性依次為放血＞脫毛＞分割＞開膛＞沖淋＞冷卻，冷卻環節胴體表面的微生物多樣性最低，分割后微生物多樣性增加，說明分割環節是生豬屠宰過程中的關鍵污染環節，這與通過傳統培養方法得到的結論一致。

表2 豬屠宰各環節樣品的α多樣性指數Table 2 α-Diversity index of samples from each stage of pig slaughter

2.2.3 不同分類學水平上物種組成分析

如圖4所示，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）和厚壁菌門（Firmicutes）是屠宰分割過程中豬胴體表面豐度最高的3個門，平均相對豐度分別為83.53%、6.09%和5.96%。變形菌門相對豐度在冷卻環節最高（98.67%），說明冷卻環節細菌在門水平相對單一，分割后細菌門顯著增加。放血和脫毛環節變形菌門的相對豐度差異不大，但脫毛環節門水平上的物種多樣性較高，可能是因為脫毛過程中胴體表面的細菌雜質黏附到全胴體。

圖4 豬胴體表面細菌門水平相對豐度變化Fig. 4 Changes in the relative abundance of bacterial phyla on the surface of pig carcass

由圖5可知，屠宰分割過程中豬胴體表面相對豐度排名前5的菌屬主要為不動桿菌屬（）、氣單胞菌屬（）、金黃桿菌屬（）、羅斯氏菌屬（）和巨型球菌屬（）。不動桿菌屬和氣單胞菌屬是生豬肉中主要的優勢菌屬，這與大多數研究一致。雖然優勢菌屬基本相同，但相對豐度差異較大。不動桿菌屬平均相對豐度為49.98%，冷卻后不動桿菌屬相對豐度最高，達到79.71%，其他菌屬僅為2.94%，說明冷卻過程能一定程度降低豬胴體表面菌群多樣性。分割后不動桿菌屬相對豐度僅為48.50%，其他各菌屬相對豐度顯著增加，說明分割是導致豬胴體微生物污染加劇的重要環節。氣單胞菌屬各環節的平均相對豐度為25.29%，但在放血環節只為1.96%，其他菌屬相對豐度高達17.58%，說明豬胴體攜帶的原始微生物種類豐富。

圖5 豬胴體表面細菌屬水平相對豐度變化Fig. 5 Changes in the relative abundance of bacterial genera on the surface of pig carcass

2.2.4 屠宰分割過程中不同環節豬胴體表面細菌雙聚類熱圖分析

根據屬水平物種的注釋結果，對分組樣品豐度進行均值計算，選擇總豐度排名前30的物種繪制屠宰分割過程中不同環節細菌的雙聚類熱圖，其可以通過顏色變化與相似程度直觀反映不同樣品間群落組成的相似性和差異性。由圖6可知，放血和脫毛環節豐度較高的菌屬在開膛、沖淋、冷卻和分割環節明顯變少，從樣本菌群結構的聚類樹可以看出，開膛和沖淋環節豬胴體表面菌落結構相似度較高，與放血、脫毛、分割和冷卻環節均存在較大差異。開膛和末端沖淋后菌群相似度較高，且與放血和脫毛后的菌群差異顯著，說明開膛前的沖淋環節能夠有效減少前期胴體表面的微生物附著，并在后續的開膛環節得到較好保持。沖淋、冷卻和分割后的菌群組成存在差異是因為冷卻能進一步減少胴體表面微生物，而分割會加大胴體表面的微生物污染。

圖6 不同環節豬胴體表面屬水平分布熱圖Fig. 6 Heatmap of genus-level distribution of bacterial community on pig carcass surface in different links

此外，傳統培養方法檢測到的優勢菌屬與測序結果存在差異。Dourou等發現，腐敗菌研究中常規的培養基計數并不總是對應于HTS分析得出的微生物群落，特別是假單胞菌、不動桿菌、光細菌和弧菌科。這是由于發光菌具有耐冷性、營養挑剔，需要NaCl才能生長，通常（非）選擇性培養基檢測腐敗菌會阻礙其生長，而HTS可檢出培養基不能計數的細菌科和屬（即不動桿菌和弧菌科（如發光菌））。同樣地，Peruzy等通過16S rRNA擴增子測序對肉糜中微生物群落進行鑒定，并與傳統分離方法進行比較，發現除肉中常見的優勢菌群，這兩種方法在同一樣本中檢測到的細菌種類不盡相同，這可能是因為大多數微生物不可培養或受培養溫度和時間的限制，并且每種培養基都具有選擇性。因此，傳統培養只能一定程度反映微生物數量以及分離鑒定特定的微生物，將傳統培養方法與HTS技術結合表征豬肉的復雜微生物區系十分必要。

3 結 論

基于傳統培養方法和HTS技術相結合分析不同屠宰環節豬胴體表面的細菌菌相組成，傳統培養方法與HTS得出的結論較為符合且相互補充，通過傳統培養方法可以明確不同環節豬胴體表面各類微生物的污染情況，HTS則可以更深入解析豬胴體表面的細菌種屬組成及相對豐度變化情況，因此，將傳統培養方法與HTS技術相結合表征屠宰過程中豬胴體復雜的微生物環境非常必要。兩種方法均表明脫毛和分割環節會加重胴體的微生物污染，脫毛環節的污染可以在后續沖淋和冷卻環節中減輕，冷卻后豬胴體表面的菌落總數達到可接受水平，但分割過程中造成的污染會直接影響豬肉出庫時的微生物安全性，因此，分割環節為屠宰過程中的關鍵控制環節，對提高出庫時豬肉的微生物安全性和控制分割過程的污染尤為重要。除嚴控分割車間的低溫、對分割車間定期消毒、在操作臺旁設置熱水槽，提高工人勤洗手、刀具的意識外，還應在分割結束后徹底清洗設備并保持干燥，開發更安全高效的消毒劑以最大程度的抑制細菌生長。另外，本研究只針對屠宰過程豬胴體的細菌菌相組成進行分析，在潮濕的屠宰分割環境中真菌也容易污染豬肉導致腐敗變質，因此屠宰過程中豬胴體表面的真菌污染情況和菌群結構也有必要進一步探索。