葡萄種質果實有機酸組分及其含量特性

牛生洋，劉崇懷，劉 強，樊秀彩，張 穎，孫 磊，張曉利,,*，姜建福,*

（1.河南科技學院食品學院，河南 新鄉 453003；2.中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

葡萄是世界上最古老、栽培面積最廣、經濟價值最高的果樹之一，其果實既可以鮮食，也用于果脯、制汁或釀酒等，具有很高的經濟和食用價值。近年來關于葡萄果實品質的研究多集中于顏色、質地、大小等果實外觀品質，然而對葡萄果實香味、營養物質、口感等內在品質研究較少。內在品質是評價果實商品食用價值的重要因素，包括糖酸組分及含量、香味、質地等，尤其是糖酸組分及含量是決定果實風味的重要指標。酸度是葡萄品質感知的主要驅動因素，直接影響消費者的偏好程度。

葡萄中的有機酸包括蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、富馬酸等。葡萄有機酸是果實代謝的主要產物之一，它的分布特征和濃度大小與葡萄果實加工特性及化學成分有著密切關系，有機酸會直接影響葡萄產品的口感平衡、化學穩定性和pH值大小。酒石酸不但是果實中主要的不可發酵可溶性酸，還是葡萄酒中的主要酸種類，對葡萄酒的風味、口感和陳釀潛力有重要影響。與酒石酸相比，蘋果酸則較為柔和，酸味爽口，給人以愉快的感覺，但高含量的蘋果酸會造成葡萄酒中乳酸含量過高，影響葡萄酒品質。檸檬酸及草酸雖然在葡萄中含量較低，但對葡萄果實風味都有重要影響。

有關葡萄有機酸組分研究已有報道，但結果不盡一致。Lamikanra等研究發現葡萄漿果中有機酸主要為酒石酸，約占總酸含量的84%，同時，還表明在葡萄漿果存在少量的乙酸、蘋果酸、檸檬酸等有機酸，以及微量的草酸與琥珀酸。Beara等研究發現釀酒葡萄中還含有其他種類的酸，如吡咯烷酮羧酸、戊二酸和2-酮戊二酸等。Topalovic等研究發現葡萄不同發育時期，果實中有機酸含量也會發生變化，通常蘋果酸和酒石酸會在葡萄果實中先積累，然后到轉色期蘋果酸含量會急劇下降，酒石酸含量緩慢增加直至不變。酒石酸與蘋果酸比例差異是種質特異性的表現，主要由遺傳背景決定。數理統計分析方法在果品風味品質研究中已逐步得到應用，借助數理統計方法能夠有效揭示指標之間的變化趨勢和定量關系。目前，潘照等利用多元線性回歸分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）法和聚類分析法等方法，對鮮食葡萄果實品質評價指標、體系及標準進行了研究，開發并建立了鮮食葡萄品質的關鍵數據庫。江雨則利用PCA法和聚類分析方法著重研究部分中國野生葡萄的果實品質。但前人研究尚未將不同用途、不同種質間葡萄果實有機酸組分及含量的差異進行對比分析，且樣本容量也相對較少。因此，本研究以國家果樹種質鄭州葡萄圃保存的302 份葡萄種質資源為研究對象，進行葡萄有機酸組分及含量的相關研究，對比不同用途、不同種質間葡萄果實有機酸組分及含量的差異，了解其有機酸含量的分布特性，明確國內富含有機酸組分的葡萄果實，以期為葡萄種質資源的充分利用和評價提供一定依據及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品于2020年在中國農業科學院鄭州果樹所國家果樹種質鄭州葡萄圃中采集。參與實驗的葡萄種質樣品共302 份（表1），每份種質3組重復。

根據往年調查采收期，在葡萄果實采收期內監測果實可溶性固形物的變化，直至其穩定，種子顏色完全變褐，開始進行果實采樣。每份種質取100 粒大小均勻、成熟度一致、無病蟲害的葡萄果實用于指標測定。將葡萄果實榨汁，經10 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清液于50 mL離心管中，經液氮冷凍后，置于-80 ℃冷藏備用。

表1 實驗使用的葡萄種質樣品Table 1 Grape germplasm samples used in this study

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀（配有2707自動進樣器、2414示差折光檢測器、2998二極管陣列檢測器） 美國Waters公司；料理機 九陽股份有限公司；砂芯過濾裝置 津騰實驗設配有限公司；pH-100A酸度計 上海平軒科學技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機酸組分及其質量濃度的測定

參照黃艷等的方法進行。

1.3.2 可滴定酸的含量和葡萄pH值的測定

可滴定酸含量的測定按照GB/T 12293—1990《水果、蔬菜制品 可滴定酸度的測定》中電位滴定法；pH值采用酸度計測定。

1.3.3 樣品酸度值的測定

酸度值計算公式如下：

式中：100、125、130、40分別為檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸的酸度值；、、、分別為樣品中檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸的質量濃度/（mg/mL）。

1.4 數據處理

利用Excel 2014進行趨勢分析，利用SPSS 20統計軟件進行相關性分析，利用Origin 2019軟件進行統計分析、PCA，利用R語言進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同葡萄果實中有機酸組成與含量特征

圖1 不同葡萄中4種有機酸組分及其含量分布圖Fig. 1 Contents of four organic acids in different grape samples

從圖1可見，302 份葡萄種質的有機酸組分均以酒石酸為主，占有機酸含量的54.87%～69.78%；其次為蘋果酸，含量占19.83%～34.68%；檸檬酸含量占4.87%～13.01%；草酸含量最低，僅占0%～6.69%。因此，葡萄屬于酒石酸優勢型水果。

結果表明，93.8%的葡萄種質酒石酸含量高于蘋果酸；5.12%的種質蘋果酸含量與檸檬酸相當（兩者之差不大于2%），如黑漢葡萄的蘋果酸與檸檬酸含量極為接近，分別占16.67%和16.78%；另有7.37%的種質蘋果酸含量高于酒石酸。此外，有些葡萄種質的某一項或幾項指標極高或極低。例如，酒石酸含量極低（＜30%）的葡萄種質有1 份（碧香無核），而含量極高（≥85%）的葡萄種質有3 份（Reliance、維金娜斯、高墨）；蘋果酸含量極低（＜10%）的種質有4 份（著色香、蓓蕾玫瑰、洛陽馮舉溝桑葉、維金娜斯），極高（≥58%）的樣品僅有1 份（樺葉葡萄老君山）；草酸含量極高（≥5.0%）的葡萄種質有5 份（白玉霓、紅伊豆、京可晶、京玉、井州1060）；檸檬酸含量極高（≥40%）的樣品有1 份（河岸葡萄）；可滴定酸含量極高（≥85%）的樣品有信陽毛葡萄和山葡萄N43-3野生葡萄，其中山葡萄N43-3的總酸質量濃度最高，為21.23 mg/mL，而安吉文的總酸含量最低。

2.2 不同用途的栽培種葡萄有機酸組成及其相關指標平均值比較

不同用途的栽培種葡萄有機酸質量濃度存在差異（表2）。釀酒葡萄酒石酸質量濃度明顯高于其他用途的葡萄，而鮮食與釀酒葡萄的酒石酸與蘋果酸質量濃度的平均比值無顯著差異（＞0.05）。酒石酸的酸性強于蘋果酸，可降低果汁的pH值。這可能導致釀酒葡萄的pH值低于鮮食葡萄與制汁葡萄。

表2 不同用途葡萄的有機酸組成及指標比較Table 2 Compositions of organic acid composition in grapes used for different purposes

2.3 不同葡萄種群的有機酸組成及相關指標平均值比較

對比不同種質葡萄中有機酸質量濃度發現，東亞種群葡萄有機酸質量濃度均高于其他種群，尤其是酒石酸質量濃度（表3）。種間雜種與北美種群葡萄的酒石酸質量濃度不存在顯著差異；種間雜種與歐亞種葡萄的草酸、蘋果酸、檸檬酸質量濃度均無顯著差異。東亞種群葡萄的酒石酸與蘋果酸質量濃度之比最低，顯著低于其他葡萄種群；而種間雜種葡萄的比值最高。種間、歐亞、東亞和北美種群葡萄的pH值之間均存在顯著差異。歐亞種的pH值最高，東亞種群葡萄的pH值最低。

表3 不同種群葡萄的有機酸組成及指標比較Table 3 Comparison of organic acid composition of different varieties of grapes

2.4 葡萄中有機酸組分及其相關指標的變異情況、相關性、PCA和聚類分析

2.4.1 葡萄有機酸組分及其相關指標的變異情況

從表4可見，樣品間pH值及可滴定酸含量變異系數相對較小，表明樣品間pH值、可滴定酸的差異較小；而草酸、蘋果酸和檸檬酸質量濃度變異系數相對較高，表明樣品間草酸、蘋果酸和檸檬酸質量濃度差異大；酒石酸質量濃度、總酸質量濃度和酸度值的變異程度中等。將各指標進行檢驗，發現8 項指標中除葡萄pH值呈正態分布外（＞0.05），其余各項指標均呈現偏態分布。

表4 不同葡萄有機酸組分變異情況Table 4 Variation coefficients of organic acids among different grape samples

2.4.2 葡萄有機酸質量濃度及其相關指標的相關性分析

表5結果表明，酒石酸與草酸質量濃度無顯著相關；除pH值與草酸質量濃度外，酒石酸質量濃度與有機酸其他指標間均呈顯著正相關。總酸質量濃度與酒石酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸質量濃度、可滴定酸含量、酸度值均呈顯著正相關。除草酸質量濃度外，pH值與有機酸其余指標均呈顯著負相關；其中pH值與可滴定酸含量的相關系數絕對值最大，為0.973。酒石酸與蘋果酸質量濃度的比值與蘋果酸質量濃度的相關系數絕對值最大（0.521），其次是酒石酸質量濃度（0.396）。同時，酒石酸與蘋果酸質量濃度的比值與pH值等呈顯著負相關，而與可滴定酸含量等呈顯著正相關。

表5 不同葡萄種質有機酸組分及其相關性Table 5 Correlation among organic acids of different grape varieties

2.4.3 葡萄有機酸質量濃度及其相關指標的PCA

利用有機酸組分、pH值、可滴定酸含量、酸度值、總酸質量濃度等作為不同的維度進行PCA，自動擬合出3個PC。由表6可知，前3個PC的累計貢獻率已達到88.80%（＞85%），說明在變量不丟失的前提下，這3個PC可以包含原始數據88.80%的信息，因此可以用這3個PC代表9個酸有關指標進行分析和評價。其中酸度值的載荷值在PC1中最大，說明酸度值對PC1影響較大，因此選擇酸度值代表PC1。在PC2中酒石酸與蘋果酸質量濃度的比值的載荷值最大，說明酒石酸與蘋果酸質量濃度的比值對PC2的影響較大，因此選擇酒石酸與蘋果酸質量濃度的比值代表PC2。PC3綜合了檸檬酸、草酸質量濃度兩個指標，但是草酸質量濃度的載荷值大于檸檬酸質量濃度的載荷值，因此可用草酸代表PC3。上述分析可得，評價葡萄有機酸品質的3個核心指標可為酸度值、酒石酸與蘋果酸質量濃度的比值、草酸質量濃度。

表6 葡萄果實有機酸組分的因子載荷矩陣、方差貢獻率及初始特征值Table 6 Factor loading matrix, variance contribution rate and initial eigenvalues of organic acids in grape berries

PC1與PC2的累計方差貢獻率達到了77%以上（表6），表明PC1與PC2兩個PC可以代表其他指標進行分析。因此，選取PC1、PC2，在PC1-PC2平面上作不同葡萄種質PC散點圖。由圖2可見，東亞種群葡萄、種間雜種、歐亞種群、北美種群葡萄PC之間有著明顯區別；此外，種間雜種與歐亞種群葡萄主要集中于坐標軸左上方附近，且兩者的重疊度較高，這可能是因為歐亞種與歐美雜種在親緣關系上比較近。

圖2 葡萄果實有機酸組分PCA散點圖Fig. 2 Scatter plot of PC1 versus PC2 for analysis of organic acids in grape berries

2.4.4 葡萄有機酸質量濃度及其相關指標的聚類分析

圖3 葡萄種質有機酸組分的聚類分析圖Fig. 3 Cluster analysis of organic acids of grape varieties

聚類分析結果表明，302 份葡萄種質一共可以分成四大類（圖3）。其中第1類（紅色）主要由華東葡萄、腺枝葡萄等12 份野生葡萄種質聚類在一起。第3類（綠色）由65.87%歐亞種、32.23%歐美雜種、1%的歐山雜種和1%的美洲種組成；其中歐山雜種和美洲種葡萄分別為熊岳白葡萄和公釀1號、早康可和俄羅斯康可。而第2類（藍色）則是由16 份歐美雜種、27 份歐亞種、5 份野生種、4 份歐山雜種和3 份美洲種葡萄組成；其中白比諾、佳麗釀、霞多麗等釀酒葡萄在第2類中占到了56.36%，而鮮食與制汁種質在其中僅占了43.64%；此外，第2類中的5 份野生種質為高山2號、福安刺葡萄、高山1號、圓葉葡萄、蘡薁-林縣；其中，福安刺葡萄、高山1號、高山2號等野生葡萄多作為釀酒葡萄使用。第4類（紫色）由11 份種間雜種、5 份歐亞種和9 份野生種葡萄組成；其中9 份野生種葡萄包括4 份刺葡萄、3 份桑葉葡萄、1 份華東葡萄、1 份秋葡萄。

3 討 論

果實有機酸含量高低直接影響葡萄果實品質，不同葡萄種質的有機酸含量與組分差異較大，篩選低酸高糖的葡萄種質，培育風味特異的葡萄新種質對葡萄產業具有重要意義。葡萄有機酸約占果汁總質量的1%，其中酒石酸與蘋果酸為有機酸的主要成分（約占總酸的90%），其他有機酸如檸檬酸、草酸和其他酸的含量受環境條件和品種的影響。

實驗中302 份葡萄種質的有機酸以酒石酸為主（1.54～12.67 mg/mL），其中山葡萄N43-3有機酸質量濃度最高，安吉文質量濃度最低；其次是蘋果酸（0.33～9.88 mg/mL），樺葉葡萄老君山的蘋果酸質量濃度最高，而Reliance的蘋果酸質量濃度最低；檸檬酸和草酸均少量存在于葡萄果實中。其中檸檬酸與草酸質量濃度與前人的檢測結果稍有出入，可能與葡萄品種或品系的差異（內因）及葡萄生長環境（光照、水分、溫度）不同有關。

栽培種葡萄果實中有機酸質量濃度由高到低為酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸，符合葡萄果實中不同有機酸分布規律，保證本研究數據可靠性。而野生種葡萄中，除刺葡萄株系外，桑葉葡萄、腺枝葡萄、華東葡萄、河岸葡萄等果實中蘋果酸質量濃度均高于酒石酸，是酒石酸質量濃度的1.2～1.7 倍，其原因有待進一步探討。但從整體而言，栽培種葡萄有機酸質量濃度普遍低于野生種葡萄，這是因為栽培品種葡萄經過人為選育，有機酸質量濃度逐漸降低，而野生種葡萄未經過人為選育，保留著原始的特性。

目前，葡萄種質資源的選育一直是以降酸為目的。但是李紀明等研究表明高糖高酸的葡萄種質更適合釀酒；劉懷峰研究也表明高酒石酸含量會在一定程度上提高漿果的釀酒品質，酒石酸含量較高的品種會使葡萄酒的顏色、氧化性更加穩定，而低酒石酸的葡萄種質釀造的葡萄酒酒體平淡、瘦弱，從而產生“泛渾病”。因此，釀酒時適量增加有機酸含量，可以使酒體更加豐滿、醇厚。本研究302 份葡萄種質中野生種葡萄有機酸質量濃度是栽培種葡萄的2～10 倍，由此可見野生葡萄資源中具有十分豐富的有機酸資源，是提供可食用有機酸的途徑之一。我國是東亞種群葡萄主要分布地，其中刺葡萄、山葡萄、毛葡萄等中國野生葡萄株系，已經應用在我國釀酒工業上，為我國的釀酒資源的增加做出貢獻。同時，高酸低糖特性使山葡萄、毛葡萄等中國野生葡萄亦可以作為種質育種時父母本，為我國的育種與資源保護做出貢獻。

研究者對多樣品多指標的品質分析越來越廣泛地應用PCA和聚類分析。聚類分析結果表明，302 份葡萄種質可以分成四類：第1類主要是由野生葡萄組成，均為高有機酸的葡萄種質；第2類不僅包括釀酒葡萄，還含有少量刺葡萄種質（如高山1號、高山2號等），可能是因為這部分刺葡萄種質的有機酸組分與釀酒葡萄較為接近，因此這部分刺葡萄種質亦可作為釀酒葡萄資源。本研究通過對酒石酸、檸檬酸、草酸和蘋果酸共4個組分的聚類分析發現，華東葡萄、腺枝葡萄、山葡萄等12 份種質為酒石酸、蘋果酸和總有機酸質量濃度較高的特異資源，可作為獲取這些組分的重要種質并加以利用。有機酸是葡萄果實代謝的主要產物之一，具有豐富的開發利用潛能。山葡萄、毛葡萄是有機酸質量濃度較高的特異種質，可在奮力提取或開發其功能產品時作為重要原料。中國野生葡萄資源十分豐富，國內研究者尚未對葡萄有機酸進行全面、系統的評價，因而對葡萄有機酸進行系統全面的評價亟待進行，以便對于中國野生葡萄資源的進一步開發利用。

4 結 論

302 份葡萄種質的有機酸主要為酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，其中山葡萄N43-3總酸質量濃度最高（21.23 mg/mL），安吉文的總酸質量濃度最低（2.91 mg/mL）。在不同葡萄種群中，東亞種群葡萄的總酸質量濃度最高，其次是北美種群，歐亞種群的總酸質量濃度最低，而在不同用途葡萄種質中，釀酒葡萄的總酸質量濃度遠高于其他兩個用途的葡萄。