基于氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用法測定葡萄果實與葡萄酒中揮發(fā)性酚

楊薇熹，張思奇，向小鳳，石 英，段長青，蘭義賓

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，葡萄與葡萄酒研究中心，農業(yè)農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

揮發(fā)性酚在葡萄酒中質量濃度范圍在μg/L至mg/L級別，由于容易辨識的香氣特征和較低的感官閾值，該類物質極易影響和修飾葡萄酒的風味。較低濃度的揮發(fā)性酚常賦予葡萄酒特殊的煙熏、皮革、香料、烘烤等香氣，但是在高濃度下表現(xiàn)為令人不愉悅的馬廄味、酚味、藥味等，破壞葡萄酒香氣的協(xié)調性。葡萄酒中的揮發(fā)性酚可能來源于橡木制品，同時，在未過桶的葡萄酒中也能檢測到揮發(fā)性酚的存在，這部分揮發(fā)性酚來源于葡萄果實。葡萄果實中的揮發(fā)性酚主要以游離態(tài)和糖苷結合態(tài)的形式存在。

由于揮發(fā)性酚在葡萄果實和葡萄酒中含量較低，再加上基質較為復雜，常規(guī)的檢測技術難以實現(xiàn)葡萄果實與葡萄酒中揮發(fā)性酚的準確定量。目前，已報道多種揮發(fā)性酚的靶向檢測方法，其中，由于較高的分離效率和靈敏度，氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術在揮發(fā)性酚的檢測分析中最為常見。近年來發(fā)展了基于氣相色譜-串聯(lián)質譜（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-QqQ-MS/MS）技術的多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方法，該方法同時具備較高的分離度和較強的靶向性，非常適用于復雜基質中痕量揮發(fā)性組分的定量分析。另外，為了進一步提高檢測效果，目前報道了多種揮發(fā)性酚的提取和富集方法，包括頂空固相微萃取、攪拌棒吸附萃取、液液萃取、固相萃取（solid phase extraction，SPE）等富集技術，以及乙酸酯化、硅烷化等衍生化方法。其中SPE方法操作簡便，可以在富集目標物質的同時除去部分雜質，在多種基質中的應用均表現(xiàn)出較強的有效性和選擇性。但是，已報道的SPE法僅針對某幾種揮發(fā)性酚的提取和檢測，并不能完整描繪葡萄酒中揮發(fā)性酚的整體輪廓。另外，這些方法僅適用于葡萄酒基質，而葡萄果實中揮發(fā)性酚及其糖苷態(tài)的檢測方法鮮有報道。為了進一步研究葡萄酒中揮發(fā)性酚來源、轉化關系和演變規(guī)律，迫切需要建立葡萄果實中游離態(tài)和結合態(tài)揮發(fā)性酚的富集和定量方法。Allen等用SPE方法分別提取了果實中的游離態(tài)和糖苷結合態(tài)揮發(fā)性酚，采用酸解法對糖苷態(tài)揮發(fā)性酚進行水解，然后對釋放出的揮發(fā)性酚進行檢測。此外，糖苷態(tài)香氣物質的水解釋放還能采用酶解法，酶解法具備更強的選擇性。

基于以上研究現(xiàn)狀，本研究采用SPE前處理方法，分別提取游離態(tài)和糖苷態(tài)揮發(fā)性酚，采用酶解法對果實中糖苷態(tài)揮發(fā)性酚進行水解。基于GC-QqQ-MS/MS聯(lián)用技術，建立葡萄果實與葡萄酒中揮發(fā)性酚的MRM定量方法，并對SPE條件進行優(yōu)化，以期為葡萄與葡萄酒中揮發(fā)性酚的研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用2020年產自新疆瑪納斯的‘赤霞珠’葡萄果實和一款2018年‘赤霞珠’干紅葡萄酒進行方法的優(yōu)化以及準確性、精密度的評價。分別在模擬葡萄酒和模擬葡萄汁體系中考察方法的線性關系。模擬葡萄酒為體積分數(shù)10%的乙醇溶液，加入7 g/L酒石酸、4 g/L葡萄糖，用氫氧化鈉將溶液pH值調至3.3。模擬葡萄汁為含有160 g/L葡萄糖和7 g/L酒石酸的溶液，用氫氧化鈉將溶液pH值調至3.3。方法驗證采用10 款商業(yè)干紅葡萄酒和10個釀酒葡萄果實樣品，見表1。

表1 用于方法驗證的葡萄酒和葡萄果實樣品Table 1 Wine and grape samples used for method validation

苯酚（99.9%）、鄰甲基酚（≥99%）、間甲基酚（≥99%）、對甲基酚（≥99%）、4-乙基苯酚（99%）、3-乙基苯酚（≥98%）、4-乙烯基苯酚（95%）、愈創(chuàng)木酚（≥98%）、4-甲基愈創(chuàng)木酚（99%）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（≥98%）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（98%）、4-丙基愈創(chuàng)木酚（≥99%）、丁香酚（98%）、異丁香酚（≥99%）、紫丁香酚（99%）、香草醛（≥98%）、丁香醛（≥98%）、松柏醛（98%）、3,4-二甲基苯酚（98%） 美國Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉、葡萄糖、檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京化工廠；酒石酸（分析純） 津科精細化工研究所；乙醇、甲醇、二氯甲烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）、--葡萄糖酸內酯（均為分析純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；無水硫酸鈉（色譜純，99%） 上海麥克林公司；AR2000糖苷酶 荷蘭DSM公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE（500 mg/6 mL） 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA223S分析天平（精度0.000 1 g） 德國賽多利斯有限公司；A 11 B S025果實研磨機 德國IKA公司；Micro 17R離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀 中國瑞科集團股份有限公司；Intuvo 9000-7010BGC-QqQ-MS/MS聯(lián)用儀、7693自動進樣器 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

葡萄果實取汁：參照Lan Yibin等的方法，稱取保存于-80 ℃冰箱的葡萄果實50 g，在液氮保護下除去果梗和種子，加入0.5 g-葡萄糖酸內酯和1 g PVPP，用果實研磨機破碎為粉末狀；粉末在4 ℃密閉環(huán)境下浸漬4 h，然后在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上層澄清葡萄汁。

葡萄果實和葡萄酒游離態(tài)揮發(fā)性酚的提取：采用相同的SPE法分別提取葡萄汁和葡萄酒中的游離態(tài)揮發(fā)性酚。利用加入標準品的‘赤霞珠’葡萄酒進行SPE方法的優(yōu)化，各目標化合物的加標質量濃度為。分別對去離子水淋洗體積和二氯甲烷洗脫體積這2個參數(shù)進行優(yōu)化，通過比較不同條件下各目標化合物的峰面積大小評價萃取效率，選擇能使各目標化合物出峰面積最大的方法作為最優(yōu)萃取方案。樣品經濾網過濾后，量取10 mL置于50 mL試管中，加入10 μL內標（3,4-二甲基苯酚，0.2 g/L溶解于乙醇）。Cleanert PEP-SPE萃取柱依次經過10 mL二氯甲烷、10 mL甲醇和10 mL去離子水活化后，樣品以2 mL/min流速通過萃取柱，用去離子水洗去糖、酸和大分子的極性物質，比較3個去離子水淋洗體積（5、10 mL和15 mL）對萃取效果的影響；游離態(tài)揮發(fā)性酚用二氯甲烷洗脫，比較了3個洗脫體積（5、10 mL和15 mL）對萃取效果的影響。收集的二氯甲烷洗脫液用1.5 g無水硫酸鈉除水后氮吹濃縮至500 μL待測。

葡萄汁中糖苷態(tài)揮發(fā)性酚的提取：葡萄汁在提取了游離態(tài)揮發(fā)性酚后，用10 mL甲醇溶液洗脫SPE柱中的糖苷結合態(tài)揮發(fā)性酚。結合態(tài)揮發(fā)性酚的酶解參考Allen等方法，收集的甲醇洗脫液在30 ℃真空條件下旋轉蒸發(fā)后，用10 mL檸檬酸-磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.0）復溶，加入200 μL AR2000溶液（0.1 g/mL，溶于檸檬酸-磷酸緩沖液），轉移至密閉離心管中，40 ℃恒溫酶解16 h。酶解后的溶液采用游離態(tài)揮發(fā)性酚的提取方法，提取酶解釋放出的揮發(fā)性酚。

1.3.2 GC-QqQ-MS/MS分析條件

GC條件：HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（＞99.999%），流速1.0 mL/min。進樣量1 μL，采用4∶1分流進樣方式，進樣口溫度250 ℃。升溫程序：起始溫度40 ℃，以5 ℃/min升至80 ℃，以2 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至160 ℃，最后以30 ℃/min升至220 ℃，后運行以280 ℃保持1 min。

MS條件：電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；輔助加熱器溫度300 ℃；MS1和MS2四極桿溫度均150 ℃。猝滅氣為氦氣，流速2.25 mL/min；碰撞氣為氮氣，流速1.5 mL/min。首先采用全掃描模式檢測目標化合物，確定各物質保留時間，選擇1～2個豐度較高、質荷比（/）較大的碎片離子作為前級離子。采用產物離子掃描模式對目標物質前級離子進行二級質譜掃描，在碎片離子中選擇豐度較高的離子作為相對應的產物離子，得到特征離子對（前級離子→產物離子），優(yōu)化碰撞能量，建立MRM方法。

1.3.3 方法評價

靈敏度和線性關系：用模擬葡萄酒（模擬葡萄汁）配制第1梯度標準品溶液（），各化合物質量濃度見表2。按照2 倍梯度稀釋方法分別得到12個梯度的模擬葡萄酒（或模擬葡萄汁）標準溶液。在每個質量濃度梯度中均加入10 μL內標（3,4-二甲基苯酚，0.2 g/L）。各質量濃度梯度標準溶液經過與樣品相同的前處理方法和GC-QqQ-MS/MS分析后，用目標化合物和內標峰面積的比值（）與相對應的質量濃度（）繪制標準曲線。將低質量濃度標準溶液繼續(xù)稀釋，直到目標化合物的峰面積比不再成線性降低（代入標準曲線后＜0.99），此時物質質量濃度作為線性范圍的最小值。檢出限和定量限的計算參考Qian Xu等的方法，以信噪比等于3對應的化合物質量濃度為檢出限，信噪比等于10對應的化合物質量濃度為定量限。

準確性和精密度：通過計算在葡萄汁和葡萄酒基質中目標化合物的加標回收率評價方法的準確性。分別用‘赤霞珠’干紅葡萄酒和‘赤霞珠’葡萄汁作為基質溶液。在100 mL容量瓶中分別加入混標，用基質溶液定容，得到2種基質下高濃度（H）和低濃度（L）的加標樣品（表2）。用1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法對原基質溶液和加標樣品進行提取和檢測，重復6 次實驗，計算加標回收率。

采用低濃度加標樣品，考察日內、日間檢測的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）以評價方法的精密度。同一日內不同時間提取檢測5 次，計算日內RSD，評價日內精密度；連續(xù)5 d同一時間進行提取檢測，計算日間RSD，評價日間精密度。

表2 揮發(fā)性酚類物質CAS編號、感官閾值及方法優(yōu)化和評價樣品的加標質量濃度Table 2 CAS number and sensory threshold of volatile phenols and spiked concentrations used for method optimization and evaluation

1.4 數(shù)據統(tǒng)計與分析

GC-QqQ-MS/MS數(shù)據分析采用Agilent Quantitative Analysis B.10.00軟件進行，目標物質依據標準品保留時間、離子碎片信息結合NIST 11標準譜庫比對進行定性分析。定量分析采用內標標準曲線法。單因素方差分析（Duncan，＜0.05）采用SPSS 20.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 儀器參數(shù)優(yōu)化

表3列出優(yōu)化后MRM方法中目標化合物的保留時間、特征離子對和碰撞能量等信息。用該方法檢測加標的葡萄酒樣品，可以檢測到20個目標物質峰（其中異丁香酚存在順反異構）和1個內標峰，目標物質所選特征離子對的掃描不受樣品中其他物質干擾，物質分離度較高、峰形良好（圖1）。

表3 揮發(fā)性酚檢測質譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters for determination of volatile phenols

續(xù)表3

圖1 加標葡萄酒樣品中目標物質MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatogram of target compounds spiked in wine samples

2.1.2 淋洗體積優(yōu)化

圖2 去離子水淋洗體積對目標化合物響應的影響Fig. 2 Effect of washing with different volumes of deionized water on the response for target analytes

在二氯甲烷洗脫體積為10 mL條件下，采用3種不同體積（5、10 mL和15 mL）去離子水淋洗萃取柱，比較目標化合物的出峰面積以評價不同體積去離子水淋洗后的萃取效果。與5 mL去離子水淋洗體積相比，采用10 mL去離子水淋洗后4-乙基愈創(chuàng)木酚、松柏醛和異丁香酚的響應顯著降低；采用15 mL去離子水淋洗后間甲基酚、4-丙基愈創(chuàng)木酚的響應顯著降低（圖2）。去離子水淋洗可以減少糖類和有機酸類物質，除去體系中的親水性雜質，但同時也可能溶解帶走部分目標化合物，使其檢測響應降低。此外，其他目標化合物的響應在不同淋洗體積下沒有表現(xiàn)出顯著差異（圖2）。綜合考慮各目標化合物的萃取效果，選擇5 mL去離子水用量作為最佳淋洗體積。

2.1.3 洗脫體積優(yōu)化

在去離子水淋洗體積為5 mL的條件下，采用3種體積（5、10 mL和15 mL）二氯甲烷進行洗脫，比較目標化合物的出峰響應，以評價不同洗脫體積對萃取效果的影響。甲基酚類、乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和丁香酚的響應在不同洗脫體積下無顯著差異。采用5 mL二氯甲烷洗脫，苯酚和4-乙烯基苯酚的響應顯著低于10 mL和15 mL的洗脫體積（圖3）。洗脫體積較少時可能存在物質洗脫不完全的情況，導致萃取到的目標化合物較少。各目標化合物在10 mL和15 mL二氯甲烷洗脫后的響應沒有顯著差異。綜合考慮各目標化合物的萃取效果，選擇10 mL二氯甲烷用量作為最佳洗脫體積。

圖3 二氯甲烷洗脫體積對目標化合物響應的影響Fig. 3 Effect of elution with different volumes of dichloromethane on the response for target analytes

2.2 方法評價

在優(yōu)化后的前處理方法和儀器檢測條件下，對該方法的檢出限、定量限、線性關系、準確性和精密度進行評價。

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限

在模擬葡萄酒和模擬葡萄汁中，19種目標物質的檢出限和定量限范圍分別為0.02～1.01 μg/L和0.08～3.36 μg/L，其中有11種物質定量限均小于1 μg/L，具有較高靈敏度。本方法中揮發(fā)性酚的檢出限和定量限比前人報道的液液萃取以及攪拌棒吸附萃取法更低或相近，遠低于化合物的感官閾值（表2）。此外發(fā)現(xiàn)，4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚的檢出限和定量限均低于其相應的乙烯基酚形式（表4），本方法對乙基酚類物質的檢測靈敏度比乙烯基酚類更高，該現(xiàn)象與前人報道相符。

如表4所示，各目標化合物在檢測范圍內線性關系較強，回歸系數(shù)（）均大于0.99。相同質量濃度梯度標準液在模擬葡萄汁和模擬葡萄酒中進行檢測，結果顯示，愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚和4-丙基愈創(chuàng)木酚等物質線性方程的斜率在2種基質中有較大差異，這些物質在模擬葡萄酒中檢測比在模擬葡萄汁中檢測所得線性方程的斜率更大。說明這些化合物的檢測容易受到基質（乙醇和葡萄糖濃度）的影響，在實際樣品檢測時，應使用相應基質中測得的標準曲線進行計算。

表4 揮發(fā)性酚檢測線性范圍、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, limits of detection and limits of quantification of volatile phenols

2.2.2 準確性評價

19種物質在葡萄汁和葡萄酒基質中的加標回收率分別為81.99%～122.72%和82.59%～112.64%（表5）。除了香草酸在葡萄汁基質中的加標回收率為122.72%以外，其他物質的加標回收率都在80%～120%范圍內，方法準確性較高。

表5 揮發(fā)性酚檢測重復性、重現(xiàn)性及加標回收率Table 5 Repeatability, reproducibility and spiked recoveries for the detection of volatile phenols%

續(xù)表5 %

2.2.3 精密度評價

該方法下，各目標化合物日內RSD小于8.26%，日間RSD小于13.25%（表5），該方法重復性良好。

Sousa等利用乙酸酐衍生結合液液萃取的方法對葡萄酒中的揮發(fā)性酚進行檢測，方法的檢出限為1.5～3.9 μg/L，加標回收率為67%～126%；Allen等報道了利用硅烷衍生結合SPE方法檢測葡萄果實和葡萄酒中的23種揮發(fā)性酚，方法檢出限為2.5～25 μg/L，加標回收率平均為73.9%～114.5%，變異系數(shù)為10.3%～21.3%；本方法的檢出限為0.02～1.01 μg/L（表4），加標回收率為81.99%～122.72%范圍，日內、日間RSD均小于15%（表5），本方法的準確性較高，穩(wěn)定性較強。

2.3 葡萄與葡萄酒中揮發(fā)性酚分析

為驗證該方法的普遍適用性，對10個葡萄果實樣品及10 款干紅葡萄酒的揮發(fā)性酚進行測定。20個樣品中均能檢出19種揮發(fā)性酚，其含量在檢測方法的線性范圍內（表2、6）。

檢測到葡萄果實中香草酸含量均值最高，其游離態(tài)和結合態(tài)總量為36.04～865.75 μg/L（圖4）。檢測到葡萄酒樣品中，4-乙基苯酚、3-乙基苯酚及4-乙烯基苯酚是干紅葡萄酒中含量均值最高的3種目標物，其質量濃度范圍較廣，分別為2.43～6 379.99、5.39～3 786.69 μg/L和32.06～869.09 μg/L，樣品間含量差異較大。檢測到一些干紅葡萄酒樣品中，4-乙基苯酚、4-乙烯基苯酚、3-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量遠高于葡萄果實中游離態(tài)和結合態(tài)總和（表4），說明這些物質有除糖苷態(tài)以外的其他前體來源。有研究表明，乙基酚類和乙烯基酚類物質可能來源于發(fā)酵過程中微生物代謝羥基肉桂酸產生，且該反應受到前體物含量、微生物類型、發(fā)酵工藝和陳釀條件等因素的影響。由于受到多種因素的影響，在葡萄酒釀造和陳釀過程中可能不同程度地生成了這些物質，所以這類揮發(fā)性酚在干紅葡萄酒中的含量范圍通常較廣（表4），本研究建立方法具備較廣線性范圍，在所需檢測范圍內大于0.99，線性較好，可以滿足檢測要求。

表6 10個葡萄果實樣品與10 款葡萄酒中揮發(fā)性酚質量濃度Table 6 Concentrations of volatile phenols in 10 grape samples and 10 wine samples μg/L

圖4 葡萄果實（A）與葡萄酒（B）中揮發(fā)性酚的含量分布Fig. 4 Distribution of volatile phenols in grape berry (A) and wine (B) samples

3 結 論

針對葡萄與葡萄酒中揮發(fā)性酚的檢測建立基于GCQqQ-MS/MS的MRM方法，采用SPE前處理方法結合糖苷酶酶解法，能夠同時滿足葡萄汁和葡萄酒中19種揮發(fā)性酚的定量分析。該方法分別在葡萄汁和葡萄酒2種基質中進行驗證，結果表明該方法具有較高靈敏度（檢出限和定量限范圍分別為0.02～1.01 μg/L和0.08～3.36 μg/L）；在檢測所需含量范圍內具備良好的線性關系（＞0.99）；加標回收率為81.99%～122.72%，日間、日內RSD不高于13.25%，方法具備較高的準確度和精密度。