新建組合填料垂直潛流濕地系統處理沿海墾區池塘養殖尾水的效果

王雪峰 ，劉文暢 ，樊利鵬，譚洪新，羅國芝 ，孫大川

(1 上海海洋大學上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；2 上海市水產動物良種創制與綠色養殖協同創新中心，上海 201306；3 江蘇省沿海開發(東臺)有限公司，江蘇東臺 224200)

2020年，中國沿海養殖池塘面積達9 613.66 km2，水產養殖已成為沿海地區土地復墾的重要途徑之一[1]。然而，沿海水產養殖一直是重要的陸源海洋污染物的輸入源，會導致沿海地下水富營養化[2]。除氮、磷等常見的污染物外，pH在沿海水產養殖中同樣需要關注。全國各級養殖尾水排放標準均要求池塘尾水的pH應小于9，超標的尾水須經處理達標后方可排放[3-4]。李云夢等[5]研究發現，濱海圍墾灘涂養殖池塘中的pH最高可達9.8。高pH除了是導致該池塘凡納濱對蝦高死亡率的原因外，亦無法滿足尾水的排放要求。人工濕地因綜合高效的處理能力在養殖尾水的處理中被重視[6]，但研究者卻很少強調其有效的降pH效果。倘若人工濕地可以兼具降低pH和去除污染物的效果，那么將進一步豐富高pH水體的處理方式，并促進人工濕地在沿海養殖中的應用。

填料是人工濕地特別是潛流人工濕地床體的主要介質，對濕地的污染物去除效果具有決定性影響[7]。石灰石、沸石等天然材料因具有官能團作用、特異性吸附位點等特殊性質而被廣泛應用[8]。風化煤是暴露在地表或位于地表淺層的煤，內含大量的再生腐殖酸和羧基、羥基等含活性基團。由于大分子腐殖酸可以通過酸堿中和和交換作用降低土壤pH，因此風化煤被廣泛應用于鹽堿地的土壤改良[9]。作為一種喜鹽耐堿的鹽生作物，堿蓬(Suaedasalsa)既能修復含鹽水體，又具有較好的經濟價值[10]。

本研究將堿蓬作為凈化植物，結合風化煤、陶瓷環和石英砂構建組合填料人工濕地，以期在去除氮、磷等污染物的同時，同步降低水體pH，從而為人工濕地在養殖尾水中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 人工濕地的構建

人工濕地共設3組作為重復，由敞口透明的有機玻璃柱構建而成(圖1)。采用圓錐體和圓柱體的復合結構，上部為圓柱體容器，直徑40 cm、高100 cm，下部為圓錐體容器，直徑40 cm、高10 cm。圓錐體的最下端開口連接排水管，排水管上依次固定出水閥門和流量計，用以調控濕地的實際出水流量。在距填料層表面約3 cm的容器側面增設一出水管，濕地多余的進水經此排出。濕地由下到上依次填充石英砂、陶瓷環和風化煤。石英砂粒徑8～16 mm，填滿整個圓錐體以及(13.50±1.22)cm高的圓柱體。陶瓷環為六角狀，由中性石英粉燒制而成，粒徑15～20 mm，實際填充高度(31.67±2.59)cm。風化煤大小不均，粒徑2～6 cm，填充高度(52.50±1.47)cm。在填料表層均勻栽種8株堿蓬，堿蓬根部使用水草泥包裹。水草泥為黑色的圓形顆粒，顆粒大小為2～5 mm。堿蓬均采集于條子泥墾區未經開墾的灘涂濕地(32°50′50″N，120°57′30″ E)。

圖1 濕地系統的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the wetland system

1.2 人工濕地的運行

濕地搭建于江蘇省條子泥墾區條南片區的一條排水渠道中(32°44′44″N，120°56′58″ E)，片區內36個12 hm2養殖池塘的尾水均經此渠道匯入黃海，水體鹽度為2.7～7.1。自2021年3月11日開始，組合填料濕地共計運行70 d，水力停留時間為4.03 h，水力負荷為2.18 m3/(m2d)。

1.3 檢測項目及方法

1.3.1 水質指標

收集濕地的上端進水和下端出水樣本，利用便攜式多參數水質測量儀(Multi 3430，德國WTW公司)測定樣本pH。按照標準方法，測定總氮(TN)、總磷(TP)和高錳酸鹽指數(CODMn)[11-12]。

1.3.2 堿蓬的生長指標

在人工濕地運行初始、終末分別留存堿蓬樣本，利用分析天平稱量鮮重，用皮尺測定株高和根長，在烘箱烘干水分后稱量干重并計算含水率。

1.3.3 硝化能力測試

1.3.4 微生物群落分析

同硝化能力測試，濕地運行結束后，將不同高度的同種填料均勻混合，風化煤分為上、下兩部分以區分是否有堿蓬根系覆蓋。以超純水作為洗滌劑，超聲波洗滌各類填料后過0.22 μm濾膜。根據E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書抽提濾膜上微生物群落的總DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA質量濃度和純度。使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增。擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

將所有序列讀數聚類到操作分類單位(OTU)(相似性閾值為 97%)，使用NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定OTU代表性序列的分類分配。為了消除不同測序深度造成的偏差，將所有測序樣本分別稀化到最低序列(36 041條)，后續分析均使用歸一化的OTU豐度數據進行。

1.4 數據分析

使用SPSS 19.0軟件對相關數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著水平取P<0.05。微生物數據在Majorbio I-Sanger云在線平臺上進行分析。

2 結果與分析

2.1 人工濕地的運行

人工濕地進、出水中的污染物質量濃度和去除率如圖2所示。墾區池塘尾水中的pH、TN、TP和CODMn分別在8.55～9.17、3.58～8.53 mg/L、0.47～1.16 mg/L和17.96～26.63 mg/L的范圍內波動。經濕地凈化后，出水中的pH、TN、TP和CODMn分別為7.34～8.79、2.75～6.65 mg/L、0.33～0.71 mg/L和16.32～24.16 mg/L。其中，pH、TP和CODMn在進、出水中的差異顯著(P<0.05)。進水的pH下降5.27%～17.83%，平均下降8.78%。出水中pH除有2次達8.56以上外，均小于8.50。首次采樣時，出水中的TN高于進水，即TN去除率表現為負值。其余時間里，濕地的TN去除率維持在15.92%～43.80%范圍,平均值為27.22%。TN去除率隨進水質量濃度上下波動，當進水中的TN高于7 mg/L時，出水中的TN并不能保持在5 mg/L以下。濕地的TP去除率在10.37%～47.76%范圍，隨運行時間增加而不斷增長，平均去除率36.26%。在第29天，濕地進水中的TP僅為0.50 mg/L，遠低于其他時段，此時TP的去除率僅為10.37%。經濕地凈化后，出水中的TP全部低于1 mg/L，并在多數情況下低于0.5 mg/L。前2次采樣時，濕地的CODMn去除率不足5%，后逐漸升高并維持在9.16%～25.53%，平均值為13.52%。經濕地凈化后，出水中的CODMn維持在15～25 mg/L范圍。

圖2 進出水中的pH、總氮(TN)、總磷(TP)和高錳酸鹽指數(CODMn)及去除率的變化Fig.2 Variation of pH,TN,TP,and CODMn and removal rates in influent and effluent

2.2 堿蓬的生長

人工濕地運轉結束后，堿蓬的鮮重、干重、株高、根系長度和含水率均出現了顯著增長(P<0.05)。運轉結束時，堿蓬的平均根系長度為(19.17±7.77)cm，接近風化煤層高度的1/2。

表1 人工濕地運行前后堿蓬的生長指標Tab.1 Growth indicators of Suaeda salsa before and after the artificial wetland operation

2.3 硝化能力測試

圖3 硝化能力測試中和的質量濃度變化Fig.3 Changes of in the nitrification capacity test

2.4 細菌群落的α和β多樣性

如表2所示，各樣本文庫覆蓋率(Coverage)均大于0.99，說明測序結果可以很好地反映樣本的真實情況。選取Ace和Chao指數估算細菌群落的豐富度，選取Shannon和Simpson指數估算細菌群落的多樣性。盡管差異不顯著，但Ace、Chao和Simpson指數均顯示上層風化煤中細菌群落的豐富度和多樣性最高。Shannon指數顯示上層風化煤和石英砂上細菌群落的多樣性顯著高于陶瓷環(P<0.05)。

表2 不同填料上細菌群落的α多樣性指數Tab.2 Alpha diversity index of bacterial communities on different fillers

使用主坐標分析(PCoA)在OUT水平展示細菌群落的β多樣性(圖4)。

圖4 不同填料上細菌群落組成的 主坐標分析 (PCoA)Fig.4 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterialcommunity composition on different fillers

不同填料上的細菌群落樣本各自聚集，上、下層風化煤間的距離接近。ANOSIM相似性分析表明，不同填料上的細菌群落組成存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 細菌群落的組成和差異

為了減少群落的復雜性和冗余性，將相對豐度低于1%的群落都歸為稀有種，并為“Others”。不同填料上細菌群落在門水平的組成如圖5所示，共有15類菌門的相對豐度超過1%。其中，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、綠彎菌門(Chloroflexi)和藍細菌門(Cyanobacteria)在濕地中的平均相對豐度超過10%。變形菌門的豐度最高，在所有填料上的相對豐度均超過20%。石英砂上擬桿菌門和陶瓷環上綠彎菌門的相對豐度也達20%以上，厚壁菌門(Firmicutes)在下層風化煤上的豐度達10%以上。方差分析表明，在上述菌門中，僅有擬桿菌門在不同填料上的相對豐度存在顯著差異(P<0.05)，其在石英砂上顯著富集(圖6)。

圖5 不同填料上細菌群落門水平上的組成Fig.5 Bacteria community structures on different fillers at the phylum level

圖6 不同填料上優勢菌門間的豐度差異Fig.6 Differences in the abundance of dominant phyla on different fillers

圖7顯示了濕地中相對豐度大于1%的菌屬。有3類菌屬的平均相對豐度大于3%，分別為藍菌屬(Cyanobium_PCC-6307)(6.84%)、norank_f_ _A4b(5.30%)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(3.20%)。除此之外，norank_f_ _Microscillaceae和unclassified_f_ _Chloroflexaceae在上層風化煤中的相對豐度達3.82%和3.52%，下層風化煤中短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的豐度達4.55%。方差分析表明，上述菌屬中，僅有norank_f_ _Microscillaceae在不同填料上的相對豐度存在顯著差異(P<0.05)，其在上層風化煤中顯著富集(圖8)。

圖7 不同填料上細菌群落屬水平上的組成Fig.7 Bacteria community structures on different fillers at the genus level

圖8 不同填料上優勢菌屬間的豐度差異Fig.8 Differences in the abundance of dominant genus on different fillers

3 討論

3.1 濕地的運行效果

江蘇省《池塘養殖尾水排放標準》中將養殖尾水受納水域分為海水、淡水兩種，標準級別定為一級和二級兩類[4]。其中，海水受納水域的限定指標不包含CODMn，用淡水受納水域的限定值代替。參照標準，條子泥墾區尾水中pH、TN、TP和CODMn分別超出二級排放標準5、3、3和4次。除TP有2次滿足外，其他指標均不滿足一級排放標準。經組合濕地凈化后，僅TN存在2次超標現象，pH、TP和CODMn全部滿足二級排放標準。其中，pH除2次高于8.50外，均滿足一級排放標準。因此，組合填料濕地對于墾區養殖尾水，尤其是對水體pH的調控具有實際意義。

組合填料濕地對于TN、TP和CODMn的去除率分別為15.92%～43.80%、10.37%～47.76%和2.56%～25.53%，平均去除率為27.22%、36.26%和13.52%，TN在進、出水中的差異不顯著。楊新萍等[13]在野外以蘆葦礫石床構建的水平潛流濕地，對于微污染河道水體TN和CODMn的去除率分別為6.10%～37.83%和12.66%～37.03%，凈化效果與本研究近似。然而，秦怡[14]通過將不同填料和植物進行組合，發現潛流濕地對于河水中TN、TP和CODMn的平均去除率高達52.99%、67.98%和44.51%。隗嵐琳等[15]研究發現，低溫條件下30 d內組合填料垂直潛流濕地對污水處理廠尾水中TN和TP的平均去除率仍可達38.5%和26.8%。比較而言，本研究中組合填料濕地的去除率較低，可能與多種因素有關。一方面，作為核心填料，風化煤的粒徑遠超過陶粒、礫石等常見填料(3～15 mm)[16]。粒徑大小是影響濕地凈化效果的指標之一，因為相同體積的小粒徑填料具有更大的比表面積，能夠提供更多的物理和化學反應位點[17]。另一方面，濕地的污染物去除率與進水濃度相關[18]。同比于城市生活污水和工業廢水，養殖尾水中的污染物含量更低，處理難度更大[6]。與此同時，組合填料濕地搭建于野外，容易受到天氣、溫度等環境因素變化的影響。

3.2 堿蓬的生長和填料的性能

3.3 細菌群落結構

門水平上，將相對豐度高于10%的菌門作為優勢菌[22]，則變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門和藍細菌門為濕地中的優勢菌門。變形菌門的豐度最高，其含有豐富的反硝化菌屬，對于系統中TN的去除起主要作用[23]。擬桿菌門中的大多細菌對有機物具有降解作用，是人工濕地中常見的菌群[24]。相對于陶瓷環和風化煤，石英砂更有利于擬桿菌門的富集。屬水平上，將相對豐度高于3%的菌屬作為優勢菌，則濕地中的優勢菌屬包括藍菌屬、norank_f_ _A4b和芽孢桿菌屬。藍菌屬為藍細菌中的一類，其在藍藻水華中常作為優勢類別出現[25]。然而，藍菌屬在人工濕地中并不常具有較高豐度[26-27]。在組合濕地運轉時，河道水體藍菌屬的富集可能直接影響了濕地中藍菌屬的豐度。norank_f_ _A4b和芽孢桿菌屬在脫氨系統中經常出現，可參與大分子有機物的降解和反硝化過程[28-29]，它們在濕地中的富集有利于水中氮和有機質的去除。已有研究發現，Microscillaceae科的細菌在好氧膜生物反應器中占據主導地位，并與有機污染物的變化呈正相關[30]。盡管無法確定準確的分類信息，但norank_f_ _Microscillaceae的富集可能會直接提高上層風化煤的凈水能力。

4 結論

在70 d的運行中，以堿蓬、風化煤、陶瓷環和石英砂新建的組合填料垂直潛流濕地系統表現出長期穩定的降pH效果。受粒徑大小、進水濃度等因素的影響，濕地對于條子泥墾區池塘養殖尾水的TN、TP和CODMn的平均去除率較低，分別為27.22%、36.26%和13.52%。養殖尾水經凈化后基本滿足江蘇省池塘養殖尾水排放二級標準，pH基本滿足一級標準。這表明組合填料濕地對于養殖尾水，尤其是對水體pH的調控具有實際意義。運行結束后，濕地中不同填料的去TAN效果和微生物群落結構不同。風化煤作為濕地填料具有應用價值，但需要確定合適的粒徑大小。

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