二苯乙烯苷對成骨細胞抗氧化損傷的保護機制

范迎賽 ， 宮新城 ， 楊 倩 ， 張 迪 ， 趙興華 ， 王曉丹 ， 史萬玉

(河北農(nóng)業(yè)大學中獸醫(yī)學院 ， 河北 保定 071000)

骨流失類疾病是畜禽常見病，可導致動物生產(chǎn)性能下降、骨骼變形、癱瘓甚至死亡，嚴重危害動物健康及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。研究表明，氧化應激是骨流失類疾病發(fā)生的重要病理基礎，活性氧對骨功能性細胞(成骨細胞和破骨細胞等)中蛋白質、脂質和核酸等大分子物質具有直接或間接的影響[1]。

正常情況下，機體骨量處于動態(tài)平衡中，由成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收2個過程進行維持，受多條細胞信號轉導通路的影響[2]。其中，Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/核因子κB受體活化因子(RANK)分別是調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的關鍵通路[3]。氧化應激條件下，成骨細胞Wnt/β-catenin通路受到抑制，使成骨細胞生存活性、分化活性和成骨活性均隨之下降 ； 此外，氧化應激還會降低成骨細胞表達RANKL/骨保護素(OPG)的比值，間接促進破骨細胞的骨吸收活動[4-5]。

中獸醫(yī)理論認為“腎主骨”，臨床中可通過補腎而抑制機體骨流失。中藥制何首烏具有補肝腎、強筋骨的功效，其主要活性成分為2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，常簡稱為二苯乙烯苷(THSG)[6]。有研究報道，THSG在體內(nèi)外試驗中均表現(xiàn)出促成骨活性，且具有較好的抗氧化能力，能夠有效減少過氧化氫(H2O2)導致的成骨細胞內(nèi)活性氧和丙二醛等的生成[7-8]。但是，其在氧化應激條件下促進成骨的作用機制尚待深入探索。本試驗使用H2O2和THSG共同作用成骨樣細胞MC3T3-E1，通過檢測成骨細胞生存活力、對破骨細胞的調(diào)控功能及Wnt/β-catenin通路活化水平等，探索THSG對成骨細胞抗氧化損傷的保護作用機制，為其藥理研究及臨床開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物及主要試劑 THSG標準品，購自國家食品藥品檢定研究院；α-MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶，均購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，購自以色列BI公司；細胞總RNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒和qPCR試劑，均購自北京全式金公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒，均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔源OPG抗體，購自美國Abcam公司；兔源GAPDH抗體、兔源β-tubulin抗體和HRP 標記山羊抗兔二抗，均購自武漢Abclonal公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 細胞株 小鼠成骨樣MC3T3-E1細胞，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組及處理 MC3T3-E1細胞鋪板24 h后，細胞密度為80%～90%時，進行試驗分組及加藥處理：(1)對照組(使用細胞培養(yǎng)基培養(yǎng))；(2)H2O2組(細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，使用含0.3 mmol/L H2O2的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng))；(3)不同濃度THSG保護組(10-3～10-5mg/mL THSG預處理1 h，使用含0.3 mmol/L H2O2及不同濃度THSG的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng))。

1.2.2 細胞生存活性檢測 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于96孔板中，THSG和0.3 mmol/L H2O2共同培養(yǎng)細胞3 d后，吸棄培養(yǎng)上清，各孔加入100 μL含1 mg/mL MTT的α-MEM培養(yǎng)基，37 ℃避光培養(yǎng)4 h。然后吸棄上清，各孔加入100 μL DMSO，避光輕柔振蕩15 min，于酶標儀570 nm處檢測OD值。以對照組為100%，計算各組細胞相對生存活性。

1.2.3 mRNA水平檢測 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于6孔板中，THSG和0.3 mmol/L H2O2共同培養(yǎng)細胞3 d后，按照說明書提取各孔細胞總RNA，并將其反轉錄為cDNA。使用ABI StepOnePlus儀器檢測mRNA水平，反應體系：2 × qPCR Mix 5 μL，Rox 0.2 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，cDNA 0.3 μL，滅菌雙蒸水4.1 μL，總反應體積10 μL。反應程序：95 ℃預變性1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，計算各組中目的基因的mRNA表達水平。目的基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 蛋白水平檢測 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于φ100 mm培養(yǎng)皿中，使用THSG和0.3 mmol/L H2O2共培養(yǎng)細胞1 d后，使用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整濃度一致后加入適量5×Loading buffer并煮沸。將蛋白進行SDS-PAGE電泳及轉膜，室溫振蕩封閉2 h后，加入相應一抗，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜后洗膜。然后使用二抗室溫孵育1 h，洗膜，使用ECL法對蛋白條帶進行顯色，使用Tanon 5200儀器采集圖像，Image J軟件分析灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白的表達水平。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 使用IBM SPSS Statistics 21軟件分析數(shù)據(jù)，在滿足方差齊和正態(tài)分布的前提下，進行單因素方差分析和Turkey多重比較，結果以平均數(shù)±標準差表示，P< 0.05表示組間差異顯著。

2 結果

2.1 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細胞生存活力的影響 結果如圖1所示，與對照組相比，H2O2組細胞生存活力顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3～10-5mg/mL THSG保護組細胞生存活力顯著升高(P<0.05)。

圖1 THSG和H2O2對MC3T3-E1細胞生存活力的影響(n=4)

2.2 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細胞BadmRNA表達水平的影響 結果如圖2所示，與對照組相比，H2O2組細胞BadmRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組相比，10-4mg/mL THSG保護組細胞BadmRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，10-3mg/mL THSG保護組BadmRNA表達水平無顯著變化(P>0.05)。

圖2 THSG和H2O2對MC3T3-E1細胞Bad mRNA表達水平的影響(n=3)

2.3 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細胞OPG和RANKL表達水平的影響OPGmRNA表達水平結果如圖3A所示，與對照組相比，H2O2組細胞OPGmRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-4mg/mL THSG保護組細胞OPGmRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，10-3mg/mL THSG保護組細胞OPGmRNA表達水平無顯著變化(P>0.05)。OPG蛋白表達水平結果如圖3B所示，與對照組相比，H2O2組細胞OPG蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護組細胞OPG蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 THSG和H2O2對MC3T3-E1細胞OPG mRNA(A)和蛋白(B)表達水平的影響(n=3)

RANKLmRNA表達水平結果如圖4A所示，與對照組相比，H2O2組細胞RANKLmRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護組細胞RANKLmRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。OPG/RANKLmRNA比值結果如圖4B所示，與對照組相比，H2O2組細胞OPG/RANKLmRNA比顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護組細胞OPG/RANKLmRNA比顯著升高(P<0.05)。

圖4 THSG和H2O2對MC3T3-E1細胞RANKL mRNA表達水平(A)和OPG/RANKL mRNA比(B)的影響(n=3)

2.4 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細胞β-catenin表達水平的影響β-cateninmRNA表達水平結果如圖5A所示，與對照組相比，H2O2組細胞β-cateninmRNA表達水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護組細胞β-cateninmRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。β-catenin蛋白表達水平結果如圖5B所示，與對照組相比，H2O2組細胞β-catenin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護組細胞β-catenin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

圖5 THSG和H2O2對MC3T3-E1細胞β-catenin mRNA(A)和蛋白(B)表達水平的影響(n=3)

3 討論

THSG具有促成骨、抗炎、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)脂質代謝、抗腫瘤、改善學習和記憶能力等多種功效[9]，具有開發(fā)成為獸藥及飼料添加劑的潛力。已有研究報道THSG可通過抗氧化作用保護成骨細胞生存及功能活性[8-10]。本試驗主要通過檢測成骨細胞OPG/RANKLmRNA表達比和Wnt/β-catenin通路活化水平等，對THSG保護成骨細胞抗氧化損傷的作用機制進行探索。

氧化損傷可通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡等途徑降低細胞生存活性。根據(jù)本試驗細胞活性檢測結果，10-3～10-5mg/mL THSG均能保護H2O2作用下成骨細胞的生存活力，本試驗選取10-3mg/mL和10-4mg/mL濃度THSG進行后續(xù)試驗。在內(nèi)源性凋亡途徑中，Bax和Bad是重要的促凋亡蛋白，Bcl-2是最具代表性的抑凋亡蛋白。其中，Bax通過增加線粒體膜通透性，釋放細胞色素C進入胞質誘發(fā)級聯(lián)反應，促進細胞凋亡；Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，抑制Bax介導的細胞凋亡；而Bad能夠結合Bcl-2，釋放Bax/Bcl-2異源二聚體中的Bax，間接促進細胞凋亡[11]。本試驗對BadmRNA表達水平的檢測結果顯示，10-4mg/mL THSG能夠顯著抑制H2O2對BadmRNA表達水平的上調(diào)作用，說明適宜濃度的THSG可抑制氧化應激誘導的Bad轉錄。張金康等[10]研究證明，THSG可抑制氧化應激導致的細胞凋亡，降低H2O2作用下成骨細胞Bax mRNA和蛋白表達水平，提高Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平。結合本試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，在氧化應激條件下，THSG可能通過下調(diào)Bad和Bax基因表達水平，上調(diào)Bcl-2基因表達水平，從而抑制成骨細胞凋亡，增加細胞生存活性。

成骨細胞不僅能夠形成骨，還通過表達OPG和RANKL等蛋白對破骨細胞進行調(diào)控。其中，RANKL與破骨細胞前體表面的RANK結合后，能夠使破骨細胞前體融合為成熟的多核破骨細胞，發(fā)揮骨吸收活性；OPG能夠競爭性結合RANKL，抑制RANKL與RANK結合，進而抑制破骨細胞分化形成及骨吸收活性[12]。有研究報道氧化應激能夠導致RANKL表達量升高和OPG表達量下降[5]，與本試驗結果中H2O2對成骨細胞OPG/RANKLmRNA比的下調(diào)作用相符。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)10-3mg/mL和10-4mg/mL濃度THSG可以抑制H2O2對OPG/RANKLmRNA比的調(diào)控作用。結合本試驗前期研究中THSG能上調(diào)成骨細胞生存活力和OPG/RANKL比的結果[13]，說明THSG對于正常狀態(tài)和氧化條件下成骨細胞OPG/RANKL比均具有正向調(diào)控功能，從而可能間接抑制破骨細胞的骨吸收活動。

Wnt/β-catenin通路是成骨細胞重要的信號轉導通路，能夠調(diào)節(jié)成骨細胞生存、功能活性及抗氧化能力等[3]。Wnt通路激活后，軸蛋白復合體與自身受體復合物結合，抑制糖原合酶激酶 3的活性，進而抑制β-catenin降解，促進β-catenin在胞質內(nèi)積累并轉位入核，調(diào)控通路下游靶基因的表達[14]。因此，β-catenin蛋白水平是Wnt/β-catenin通路活化狀態(tài)的重要標志。本試驗結果表明H2O2能夠下調(diào)成骨細胞β-catenin水平，而THSG可以上調(diào)成骨細胞β-catenin水平，說明THSG能夠拮抗氧化損傷對細胞Wnt/β-catenin通路的抑制作用。有研究證明THSG能夠激活骨質疏松模型小鼠Wnt/β-catenin通路[15]，與本試驗中THSG對成骨細胞Wnt/β-catenin通路的激活作用相互印證。成骨細胞中β-catenin可正向調(diào)控細胞生存活力和OPG/RANKL比[16]，結合本試驗結果，推測THSG通過Wnt/β-catenin通路保護成骨細胞的生存活力及其對破骨細胞的抑制作用，抵抗H2O2導致的氧化損傷。

綜上，THSG能夠保護成骨細胞抗氧化損傷，作用機制與上調(diào)成骨細胞生存活力、OPG/RANKL比及Wnt/β-catenin通路活化水平等相關。