43例食管癌患者不同部位DNA聚合酶β基因檢測臨床分析

許興和，曹 娟，寧召鋒

(泰安市腫瘤醫院，山東 泰安 271000)

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43例食管癌患者不同部位DNA聚合酶β基因檢測臨床分析

許興和，曹 娟，寧召鋒

(泰安市腫瘤醫院，山東 泰安 271000)

目的 比較觀察食管癌患者不同分化程度癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織中DNA聚合酶的表達差異。方法 采用RT-PCR檢測方法對臨床確診并手術病理證實的43例食管癌患者進行癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織進行polβ mRNA定量分析。結果 不同分化程度癌組織之間及癌旁組織中polβ mRNA表達水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，而正常食管黏膜組織中polβ mRNA表達水平均低于癌組織及癌旁組織(P均<0.05)。結論 食管癌中存在polβ基因啟動子突變現象，且隨距瘤體距離變化，polβ表達可能存在梯度差異。

食管癌；DNA聚合酶β；基因檢測；RT-PCR

DNA聚合酶(DNA polβ)是哺乳動物細胞內主要的堿基切除修復酶，參與DNA損傷的修復，在體內正常情況下呈低表達，polβ異常表達的細胞顯示堿基切除修復功能的缺乏及增加對堿基損傷物質的敏感性，也會增加抑癌基因、原癌基因等其他與控制生長有關的重要基因的突變頻率，從而使腫瘤的發生概率升高。在人類前列腺癌、膀胱癌、肝癌、非小細胞肺癌及結直腸癌中都有DNA polβ基因突變[1]。食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，趙國強等[2]報道食管癌高發區河南省林州市食管癌組織中polβ基因突變情況，并報道突變率為36%。本課題組分析研究我院43例手術患者polβ基因突變情況，報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取我院2012年3月至2014年6月收治并確診的食管癌患者43例，均經手術治療，其中男29例，女14例；術后病理示高分化癌5例，中分化鱗癌22例，低分化鱗癌16例。組織選取癌組織、腫瘤邊緣0.5 cm內組織、腫瘤切緣部分組織(正常食管黏膜組織)，腫瘤切緣嚴格按照腫瘤切除原則距腫瘤邊緣>5 cm，且術后病理證實切緣陰性。組織切除標本離體后15 min內放入液氮中保存，標本均經山東省泰山醫學院附屬醫院病理室檢驗證實。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑(德國QI-AGEN公司)；β-actin引物(上海寶萊生物科技技術有限公司)；PCR儀(德國Peqlab公司)；AMV、Taq酶、dNTP(美國Promega公司)；PCR引物(北京索萊寶科技有限公司)；PCR Marker(DL2000)(上海凱斯泰爾生物科技有限公司)；凝膠自動成像儀、水浴式電轉印槽、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；高速臺式離心機、高速冷凍離心機(湖南湘立科學儀器廠家)；隔水式恒溫培養箱(上海精宏有限公司)；穩壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 檢測方法 polβ mRNA檢測：1)總RNA的提取: 術中取得的新鮮病理組織,加液氮研碎,用總RNA提取試劑盒提取總RNA，將其溶于滅菌純水中,用紫外分光分度計測定所取總RNA的濃度、純度，瓊脂糖電泳觀察完整性；2)RT-PCR:AMV逆轉錄酶作用下完成逆轉錄，詳細過程參考文獻[3-4]；3)產物經凝膠成像系統(SYNGENE)分析,以目的基因/β-actin積分灰度值作為目的基因mRNA的相對表達量，根據正常黏膜表達水平推斷若該比值>0.446 9為高表達，反之為低表達。合成引物的序列及PCR產物片段長度見表1。

表1 合成引物的序列及PCR產物片段長度

2 結果

采用RT-PCR檢測方法對43例食管癌患者進行癌組織、癌旁組織及正常食管黏膜組織進行polβ mRNA定量分析，結果顯示，不同分化程度癌組織之間及癌旁組織中polβ mRNA表達水平比較差異均無統計學意(P均>0.05)，而正常食管黏膜組織中polβ mRNA表達水平均低于癌組織及癌旁組織(P均<0.05)。見表2，圖1、2。

表2 不同組織中polβ mRNA表達情況

圖1 不同組織中polβ mRNA表達情況

圖2 不同分化程度癌組織中polβ mRNA表達情況

3 討論

我國是食管癌高發國家，全世界約50%的病例發生在中國，在我國，食管癌的死亡高居第4位，占全部惡性腫瘤死亡的16.05%，且發病率逐年上升[5-6]。

文獻研究[2,7-9]發現，食管癌的發生是多因素、多階段的復雜過程，在外界因素的持續影響刺激下，多種有害或有益的突變的相互作用達到機體損傷、修復的閾值時，將導致癌變發生。DNA polβ是一種DNA修復酶，廣泛存在于細胞核內，是堿基切除修復系統中的核心成分，參與對DNA輻射損傷或化學損傷的修復合成，是哺乳動物體內復制保真度最低、最不精確的DNA聚合酶[10-12]。Jelezcova等[13]及Goellner等[14]各自團隊研究指出高表達的polβ可能參與了腫瘤細胞的增殖并同時導致對一些抗腫瘤藥物及射線的耐受。

鑒于大量關于polβ的高表達促進了腫瘤的起始、演進，并在腫瘤細胞耐藥中可能發揮作用的報道，本文研究了polβ在食管組織中的表達情況，對比分析polβ在食管病變各階段的水平，以期尋找差異，為食管癌早診、早治提供參考依據。

本研究結果顯示，polβ在癌組織、癌旁組織中的表達水平比較差異無統計學意義(P均>0.05)，但明顯高于正常食管黏膜組織(P均<0.05)。分析原因可能是：癌旁組織光鏡下未見明顯病理學改變卻已存在分子基因水平的改變，其早于臨床病理學出現，因而不能視為正常組織。提示polβ基因啟動變異極有可能發生在食管癌癌變之前。這一區域是臨床關注的焦點，可能為潛在癌變區，這些組織可能是造成惡性腫瘤局部復發的重要原因，意味著現行腫瘤切除邊緣安全標準是否需進一步考證。趙四敏等[1]研究發現，食管不典型增生組織內已存在polβ突變，與癌組織及癌旁組織基本類同，但與正常食管黏膜組織存在顯著差異，因本組所納入患者未發現不典型增生存在，因而未行相關對比，但實際臨床發現眾多存在不典型增生的患者隨訪未出現癌變，其內可能存在更細微的差異，后續還需進一步深入研究，為不典型增生演化進展為食管癌提供參考指標。

總之，食管癌中存在polβ基因啟動子突變現象，且隨距瘤體距離變化，polβ表達可能存在梯度差異。

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許興和(1976-)，男，主治醫師，主要從事食管癌的臨床診斷與治療工作。E-mail：33756916@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.023

R735.1

B

1673-5412(2016)05-0442-03

2016-01-22)