賴氨酸羥化酶2在原發性肝癌組織中表達及其對肝癌細胞遷移、侵襲影響

文 斐， 顧 磊， 胡志勇

鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）1.病理科；2.消化內科，湖北 黃石 435000

原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為發病率和病死率均較高的惡性腫瘤，已成為威脅我國人群生命安全的主要惡性腫瘤之一［1］。多數HCC患者在臨床確診時已不易手術切除，即使手術切除，復發轉移率依然較高［2-3］。有研究報道，細胞外基質在腫瘤細胞侵襲轉移中發揮重要作用，尤其是膠原纖維交聯重構，為腫瘤細胞發生遠處轉移搭建了平臺［4］。賴氨酸羥化酶2（procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2）作為PLOD家族的重要成員，是膠原纖維交聯重構過程中關鍵性的催化酶［5］。已有研究報道，PLOD2可通過影響膠原纖維交聯參與腫瘤細胞侵襲轉移［6］。本研究旨在探討PLOD2在HCC組織中的表達，并觀察HepG2細胞轉染PLOD2干擾序列后對癌細胞遷移、侵襲的影響。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2017年5月至2019年5月于鄂東醫療集團黃石市中心醫院行手術治療的93例HCC患者的癌組織及癌旁組織為研究對象。納入標準：患者術前均未行放化療；病理學檢查證實為肝細胞癌。其中，男性69例，女性24例；平均年齡（58.62±12.41）歲；腫瘤直徑＞5 cm者42例，腫瘤直徑≤5 cm者51例；分化程度：低分化31例，中分化29例，高分化33例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期39例；38例存在淋巴結轉移。本研究經醫院倫理委員會批準。所有患者均行知情同意。

1.2 主要試劑 兔抗人PLOD2多克隆抗體購自上海鈺博公司，免疫組化試劑盒及配套試劑購自北京中杉公司，HepG2細胞購自上海信裕生物公司，胎牛血清、青-鏈霉素、RPMI-1640培養液購自美國Gibco公司，Trizol總RNA提取試劑盒和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄和PCR擴增試劑盒購自日本TaKaRa公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。由上海美軒生物科技有限公司設計合成目的基因干擾序列及對照序列。引物由上海生工生物公司設計合成。

1.3 免疫組織化學法 檢測PLOD2蛋白表達 將組織石蠟標本連續切片，烤片、脫蠟至水，浸入3%過氧化氫以滅活內源性過氧化物酶，浸入枸櫞酸緩沖液中高溫、高壓抗原修復，PBS沖洗3次，10%山羊血清封閉。加入按1：500稀釋后的一抗兔抗人PLOD2抗體，4℃條件下孵育過夜，滴加二抗，反應60 min，DAB顯色，蘇木素復染，陰性對照組采用PBS替代。顯微鏡下觀察，PLOD2蛋白主要表達于細胞質中，隨機取5個高倍視野，根據染色情況和陽性細胞數進行評分［7-8］；（1）染色情況，無著色0分，淺黃1分，棕黃2分，黃褐3分；（2）陽性細胞數，染色細胞比例＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，比例≥76%為4分；（3）結果判定根據染色情況×陽性細胞數得分，0～2分為陰性（-），評分≥3分為陽性（+）。

1.4 細胞培養及處理 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養HepG2細胞，條件：37℃含5% CO2。取對數生長期細胞，按2×106個／孔接種于6孔板，過夜培養。根據轉染試劑盒說明，采用穩定轉染的方法分別對細胞進行轉染。（1）PLOD2干擾組，轉染PLOD2基因的干擾序列 正 義 鏈：5’-GCUCCAUAUGUCAACCGUA-3’，反 義 鏈：5’-UACGGUUGACAUAUGGAGC-3’；（2）陰性對照組轉染陰性對照序列：正義鏈：5’-CCACTAATGTCCAGCGTTT-3’，反 義 鏈：5’-ACAAGTAGCTGATATTGAT-3’；（3）空白組僅加入轉染液。轉染后培養48 h，完成后續實驗。

1.5 實時熒光定量PCR檢測PLOD2 mRNA表達 取各組培養48 h細胞，加入裂解液，提取總RNA并檢測濃度。逆轉錄獲得cDNA，按擴增試劑盒說明對引物擴增。引物序列：PLOD2：上 游：5’-ATGGAAATGGACCCACCA-3’，下 游：5’-TGCAGCCATTATCCTGTGTC-3’；β-actin：上游：5’-CCTCATGAAGATCCTCACCGA-3’，下 游：5’-TGCCAATGGTGATGACCTGG-3’。反應條件：95℃、2 min，95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，循環38次，利用2-△△Ct法獲得PLOD2 mRNA在細胞中的相對表達量［9］。

1.6 劃痕實驗 在6孔板底部劃橫穿孔的直線，每孔劃5條。取各組細胞，按5×104個／孔接種在6孔板，加入含血清的RPMI-1640培養液。細胞融合度＞90%時，垂直于孔板橫線用槍頭劃痕，PBS沖洗，加入無血清培養液。分別在0 h和24 h時測量劃痕寬度，重復實驗3次。

劃痕愈合率［10］=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）／0 h劃痕寬度×100%

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 用不含血清培養液對Matrigel基質膠進行稀釋，平鋪在Transwell小室上室，風干備用。取各組培養48 h的細胞，用不含血清的培養液重懸細胞沉淀，密度調整為2×105個／ml。Transwell小室上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養液。24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，將上室中散落的細胞清除，倒置顯微鏡觀察，計算穿膜細胞數量［11-12］，重復實驗3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗；計數資料以例（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLOD2蛋白表達情況 HCC組織PLOD2蛋白表達陽性率為77.42%（72／93），高于癌旁組織的33.33%（31／93），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖 1 PLOD2蛋白表達（a.HCC組織； b.癌旁組織；SP×400）

2.2 HCC組織PLOD2蛋白表達與臨床指標相關性 PLOD2蛋白陽性表達率與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移和微血管侵犯有關（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC組織中PLOD2蛋白表達與臨床病理指標相關性

2.3 3組細胞PLOD2 mRNA表達量比較 PLOD2干擾組PLOD2 mRNA相對表達量為（0.22±0.11），低于陰性對照組的（1.03±0.08）和空白組的（1.00±0.07），差異有統計學意義（P＜0.005）。

2.4 3組細胞細胞遷移能力比較 PLOD2干擾組24 h時劃痕愈合率為（43.91%±3.44%），低于陰性對照組的（60.37%±4.47%）和空白組的（63.17%±6.68%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.5 3組細胞侵襲能力比較 PLOD2干擾組侵襲細胞數（81.81±4.19）個，低于陰性對照組的（133.91±6.72）個和空白組的（128.11±7.87）個，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖 2 劃痕實驗檢測結果（a.PLOD2干擾組0 h；b.陰性對照組0 h；c.空白組0 h；d.PLOD2干擾組24 h；e.陰性對照組24 h；f. 空白組24 h）

圖 3 Transwell法檢測結果（a.PLOD2干擾組；b.陰性對照組；c.空白組；200倍）

3 討論

腫瘤細胞侵襲轉移與細胞周圍的微環境密切相關［13］。其中，細胞外基質是微環境的主要構成部分，而細胞外基質中的膠原纖維交聯增多、硬度增加為腫瘤細胞快速運動及遠處轉移搭建了平臺［14］。在此過程中，PLOD2是調控膠原蛋白合成，促進膠原纖維交聯、重構的主要賴氨酸羥化酶［15］。有研究報道，食管鱗癌組織中PLOD2高表達，參與了細胞遷移和侵襲［16］。此外，PLOD2蛋白在腎透明細胞癌［17］、喉癌［18］、肺腺癌［19］組織中表達也明顯增多。本研究結果顯示，PLOD2蛋白在HCC組織中陽性表達率升高，說明HCC組織中PLOD2蛋白高表達可能與HCC發生有關。進一步分析不同臨床指標患者PLOD2蛋白的表達情況，結果顯示，PLOD2蛋白陽性表達率在低分化、Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移和微血管侵犯的患者癌組織中升高，提示PLOD2蛋白可能與HCC惡性化進展及侵襲轉移有關。

本研究利用轉染PLOD2干擾序列的方法對人肝癌細胞HepG2進行分組處理，結果顯示，PLOD2干擾組PLOD2 mRNA相對表達量降低，說明PLOD2干擾組PLOD2基因表達被成功抑制。有研究報道，PLOD2驅動IL-6／STAT3信號通過激活整合素β1促進口腔鱗狀細胞癌的侵襲和轉移［20］。另有研究報道，PLOD2可能通過上皮-間質轉化促進子宮內膜癌細胞侵襲［5］。本研究結果顯示，PLOD2干擾組24 h時劃痕愈合率較陰性對照組和空白組降低，說明PLOD2參與了細胞遷移過程，抑制細胞中PLOD2基因表達可抑制細胞侵襲。

綜上所述，PLOD2蛋白在HCC組織中呈高表達，且與惡性進展指標有關，在發生淋巴結轉移和微血管侵犯的組織中表達明顯升高，下調PLOD2基因表達可明顯抑制人肝癌細胞HepG2遷移和侵襲，但有關的分子機制仍需進一步研究明確。