雙氫青蒿素對MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用及其對濾泡輔助性T細胞的調控作用

薛美娟，黃俊霞，楊 驥

復旦大學附屬中山醫院皮膚科，上海 200032

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是多種因素共同作用而導致免疫功能異常的自身免疫性疾病，可累及全身多種組織和器官。SLE的主要特征是產生大量自身抗體，形成免疫復合物在組織中沉積，導致補體激活，自身反應性細胞增多［1-2］。濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cells，TFH）作為一類特殊的CD4＋T細胞亞群，其主要作用是輔助B細胞分化增殖、抗體分泌，B細胞產生大量自身免疫性抗體，造成SLE免疫炎癥損傷［3-4］。TFH細胞及分泌的IL-21增多與SLE病情活動度、自身抗體分泌正相關［5-6］。

青蒿素及其衍生物除抗瘧作用外，雙氫青蒿素高效且低毒，有較明顯的免疫抑制作用，有良好開發前景，但有關雙氫青蒿素治療SLE的免疫研究機制仍較少［7-10］。有研究［11］表明，雙氫青蒿素在SLE中發揮免疫調節作用，通過調節Th17/Treg平衡，抑制Th17細胞分化及促炎作用，促進Treg細胞分化及其免疫抑制作用。迄今未發現關于雙氫青蒿素對狼瘡鼠體內外TFH細胞的調控研究。本研究旨在探討雙氫青蒿素對狼瘡鼠的治療作用，及其在體內外對TFH細胞分化的調控作用，為雙氫青蒿素應用于紅斑狼瘡治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料雌性MRL/lpr狼瘡鼠購買自中科院上海生命科學院斯萊克實驗動物有限公司；雙氫青蒿素（相對分子質量284.35）購買自CSNpharm公司；IL-21和IL-6于Peprotech公司購買；初始CD4＋T細胞分選試劑盒和T細胞活化/擴增試劑盒購買自德國美天旎公司（Miltenyi Biotec）；尿蛋白檢測試劑盒來自南京建成生物工程研究所；異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4流式抗體、別藻藍蛋白（APC）-CXCR5流式抗體、藻紅蛋白（PE）-PD-1流式抗體均來自于BD公司。IL-21酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購買自R&D Systems公司。

1.2 實驗動物分組及處理12只12周齡的雌性MRL/lpr鼠，飼養于我院SPF級動物房，體質量（30.1±2.1）g。隨機數字表法將小鼠隨機分為2組，雙氫青蒿素治療組和對照組，每組各6只。通過查閱相關文獻［11-13］及咨詢CSNpharm公司實驗人員，100~150 mg/kg雙氫青蒿素灌胃治療可有效治療狼瘡癥狀。本研究體內實驗予150 mg/kg雙氫青蒿素灌胃給藥，1次/d，持續給藥4至16周，對照組以同樣方法PBS溶液灌胃給藥。治療結束時使用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白，之后處死狼瘡鼠，取脾稱重，剪碎研磨脾臟從其中分離單個核細胞，之后用FITC-CD4、PE-PD-1、APC-CXCR5流式抗體，4℃避光染色20 min，上機檢測圈出CD4＋T淋巴細胞，再從CD4＋T的淋巴細胞圖中圈出PD-1＋和CXCR5＋的淋巴細胞，計算CXCR5＋PD-1＋淋巴細胞在CD4＋細胞中的百分比。取腎臟，放入4%多聚甲醛固定，其后經脫水透明處理后，樣品浸蠟包埋，病理切片機切片，根據H-E染色進行腎臟病理評分，評分方法參考該文獻［14］。收集血清，ELISA試劑盒檢測治療組和對照組抗ds-DNA抗體及ANA抗體含量。

1.3 體外TFH細胞培養誘導分化及流式檢測從對照組MRL/lpr狼瘡鼠中分離單個核細胞，初始CD4＋T細胞試劑盒分選初始CD4＋T細胞，在細胞培養液中加入10 ng/mL IL-21、20 ng/mL IL-6和T細胞活化/擴增試劑盒中的MACSiBeads Particles誘導分化5 d，不同濃度梯度（0 μM、0.1 μM、1.0 μM、10 μM）雙氫青蒿素干預，共分為4組。體外培養5 d后，用FITC-CD4、PE-PD-1、APCCXCR5流式抗體4℃避光染色20 min，流式細胞儀檢測CD4＋CXCR5＋PD-1＋T細胞在CD4＋T細胞中的比例。

1.4 IL-21水平測定收集上述TFH細胞培養上清，根據IL-21 ELISA試劑盒說明書檢測TFH細胞分化過程中分泌的IL-21含量。

1.5 統計學處理采用GraphPad Prism 7.0軟件，通過Studentt檢驗和方差分析進行統計學分析，計量資料以x±s表示。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 雙氫青蒿素對MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用結果（圖1、表1）顯示：雙氫青蒿素系統治療MRL/lpr小鼠4周后與對照組相比較，24 h尿蛋白含量更低，分別為（1 536±150.1）μg/24 h和（2 548±93.30）μg/24 h，t＝5.726，P＜0.01。雙氫青蒿素治療組腎臟病理評分是2.410±0.535，對照組為5.713±0.662，t＝6.716，P＜0.01。治療組抗ds-DNA抗體低于對照組［（345.3±29.00）vs（477.8±20.07）IU/mL，t＝7.514，P＜0.01］，治療組ANA抗體也低于對照組［（514.5±19.64）vs（726.3±16.27）IU/mL，t＝8.302，P＜0.01］。

圖1 雙氫青蒿素治療MRL/lpr狼瘡鼠腎炎H-E染色圖

表1 雙氫青蒿素治療組對MRL/lpr狼瘡鼠的治療作用

2.2 雙氫青蒿素抑制MRL/lpr狼瘡鼠體內外的TFH細胞分化雙氫青蒿素治療MRL/lpr狼瘡鼠4周后，可有效抑制MRL/lpr狼瘡鼠脾臟增生，治療組脾臟重量（0.28±0.03）g，對照組（0.69±0.04）g（t＝13.83，P＜0.01）。 雙 氫 青蒿素治療組和對照組脾臟中TFH細胞比例分別為（12.40%±2.726%） 和（36.33%±2.750%），t＝10.71，P＜0.01，見圖2。體外培養TFH細胞，0 μM與 0.1 μM、1.0 μM、10 μM雙氫青蒿素干預，CD4＋CXCR5＋PD-1＋TFH細胞比例和分泌的IL-21水平隨著雙氫青蒿素濃度增加而降低，相鄰2組間差異均有統計學意義（圖3）。

圖2 流式檢測MRL/lpr狼瘡鼠脾臟中CD4＋ CXCR5＋ PD-1＋ TFH細胞百分比

圖3 雙氫青蒿素體外抑制MRL/lpr狼瘡鼠TFH細胞分化及其IL-21的分泌

3 討 論

SLE是一種常見的累及多系統多器官的自身免疫性疾病，目前主要的治療藥物為糖皮質激素，某些特定類型的SLE亦可使用環磷酰胺和生物制劑等免疫抑制劑，但長期使用糖皮質激素和免疫抑制藥物會引起諸多嚴重不良反應。因此，進一步研究SLE免疫學發病機制，尋找新的高效低毒治療藥物，對提高SLE診療水平具有重要意義。

SLE是一種以B細胞過度活化和致病性自身抗體形成增加為特征、累及全身系統器官的自身免疫性疾病。TFH細胞主要輔助B細胞向漿細胞分化、促進抗體分泌。諸多前期研究［5,15］發現SLE患者外周血中TFH細胞比例增多，與自身抗體滴度正相關，并與SLE病情活動密切相關。在MRL/lpr狼瘡鼠中也證實TFH細胞和其分泌的IL-21與生發中心擴增和自身抗體分泌密切相關［6］。SLE發病與TFH細胞過度活化和IL-21過量分泌密切相關，因此抑制TFH細胞分化和功能可能進一步抑制B細胞過度活化和抗體分泌，從而TFH細胞可作為治療SLE的有效靶點［16］。

自屠呦呦教授團隊因研發青蒿素獲諾貝爾獎后，青蒿素及其衍生物的研究備受關注。青蒿素化學結構中含過氧橋結構，可產生大量水溶性和脂溶性衍生物，如雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯等。雙氫青蒿素除有抗瘧疾作用外，還具有免疫調節作用［7,17-18］。例如，有研究［9］顯示，雙氫青蒿素衍生物DC32通過恢復Treg/Th17平衡和下調IL-6來減輕小鼠膠原誘導的關節炎。雙氫青蒿素通過抑制MRL/lpr鼠中Toll樣受體4信號通路的激活和脾細胞中Ⅰ型干擾素的產生進而緩解狼瘡炎癥損傷［13］。本研究發現雙氫青蒿素可有效緩解狼瘡鼠腎臟損傷，降低24 h尿蛋白、抗ds-DNA抗體和ANA抗體滴度，可有效抑制狼瘡鼠脾臟增生、抑制TFH細胞增生。體外研究表明，雙氫青蒿素可劑量依賴性抑制TFH細胞分化及IL-21的分泌，提示雙氫青蒿素可能通過抑制TFH細胞擴增分化及其細胞因子分泌，從而達到治療狼瘡的作用。

綜上所述，本研究僅從雙氫青蒿素對TFH細胞的影響揭示了部分治療機制，而緩解狼瘡發病的其他機制還有待更多研究。雙氫青蒿素具有較為明確的抗炎和免疫調節作用，隨著相關研究的增多，有望應用于SLE等自身免疫性疾病的治療。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。