觸腦脊液神經元生理特性與功能的研究進展

2022-07-08 04:08:48王洪超何宇祺李青

醫學綜述 2022年12期

關鍵詞：小鼠

王洪超，何宇祺，李青

(1.貴州醫科大學臨床醫學院，貴陽 550025； 2.貴州醫科大學附屬醫院創傷骨科，貴陽 550004)

觸腦脊液神經元(cerebrospinal fluid-contacting neurons，CSF-cNs)簡稱觸液神經元，是一組直接與腦脊液接觸的中間神經元亞群，產生于神經發育晚期。有學者首次在兩棲動物視網膜中觀察到直接與腦脊液接觸的雙極神經元[1]。隨后，Dale等[2]在許多脊髓動物中發現了雙極神經元能夠在第三腦室和脊髓中央管區域通過頂端延伸接觸腦脊液，并稱其為“KA(Kolmer-Agduhr)細胞”。1989年，Vigh-Teichmann和Vigh[3]將此類神經元正式命名為“CSF-cNs”。它幾乎存在于所有脊椎動物中，可分為室管膜上、室管膜下和遠位CSF-cNs三類[4]。既往人們認為，CSF-cNs所處的位置及其纖毛表明它可以感知腦脊液流動、壓力及pH值的變化，并分泌神經遞質[5]，還可參與疼痛、應激和藥物成癮等[6]。但因缺乏特異性標志物，人們對其功能仍不十分清楚。有研究證實，多囊腎病蛋白2-樣1離子通道(polycystin kidney disease 2-like 1，PKD2L1)可特異性標記脊椎動物室管膜區與腦脊液接觸的CSF-cNs群體，目前多采用PKD2L1特異性抗體對CSF-cNs進行免疫熒光及免疫組織化學標記[7-8]。PKD2L1+CSF-cNs是γ-氨基丁酸能神經元，現已證明其在體外具有神經干細胞特性，是內源性神經干細胞組成之一[9]。因此，研究其生理功能可能為脊髓損傷后的內源性修復提供新的切入點?，F就CSF-cNs生理特性與功能的研究進展予以綜述。

1 CSF-cNs的分布及分類

在哺乳動物中，CSF-cNs的主要類型位于脊髓中央管的室管膜層及脊髓實質內，其他分布于腦室管膜附近，如側腦室、第三腦室、導水管下部(Aq)和第四腦室(4V)底板上部的腹側灰質內[10]，也存在于海馬、中縫背核等腦實質內[11]。

根據CSF-cNs的形態和與室管膜的位置關系，其可以分為三類：①室管膜上CSF-cNs，其胞體位于脊髓中央管的室管膜表面，直接與腦脊液相接觸；②室管膜下CSF-cNs，其胞體位于室管膜層，多為雙極，通過軸突延伸至腦脊液或鄰近的腦實質，其樹突粗短，末端膨大，表面含有動、靜纖毛，可感受腦脊液機械和化學變化；③遠位CSF-cNs，其胞體位于距離室管膜較遠的腦實質，呈梭形或多邊形，樹突豐富，軸突較長，伸向鄰近腦室或其他腦區[4,12]。

2 CSF-cNs的發育起源

在小鼠和斑馬魚等脊椎動物中，CSF-cNs起源于兩個不同的祖細胞結構域，其特征是表達不同的轉錄因子[13-14]。除了祖細胞結構域，神經發生的時間在神經元多樣化中起決定作用。為了確定腦脊液中樞神經系統發育的時間，Petracca等[15]在小鼠中，通過轉錄因子GATA2和GATA3以及離子通道PKD2L1陽性表達來鑒定CSF-cNs，他們在胚胎發育第14.5天時發現了第一個PKD2L1+細胞，此發育階段被稱為神經膠質細胞和室管膜細胞生成期，脊髓神經發生基本消失[16-17]，但隨著發育的進行，CSF-cNs數量增加，在第16.5天后保持相對恒定。研究表明，小鼠CSF-cNs起源于兩個不同的中央管背、腹側坐標的晚期祖細胞：①CSF-cNs′細胞約70%來源于Olig2+p2區域的Nkx6.1+/Pax6+祖細胞，約30%源自Olig2+的pOL區域的后半部；②CSF-cNs″細胞則由l-p3區域中的Nkx2.2+/Foxa2+祖細胞分化而來[15]。斑馬魚脊髓中央管中的KA細胞由KA′和KA″兩個亞群組成，其中KA′細胞來自PMN區域中的Olig2+祖細胞，KA″細胞是由LFP區域中的Nkx2.2a+/Nkx2.9+祖細胞分化而來[18]。雖然小鼠的CSF-cNs和斑馬魚的KA細胞在背腹位置和標記表達上有相似之處，但與小鼠CSF-cNs的晚期發育相比，斑馬魚中KA細胞的出現于自身其他脊髓神經元發生之前或同時發生[19-20]，這種異時性發育可能與羊膜動物和非羊膜動物中CSF-cNs和KA的不同功能有關[15]。

3 CSF-cNs的示蹤劑和特異性標志物

3.1示蹤劑的演變為尋求可靠的標記方法，Song等[11]對辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和霍亂毒素亞單位B與HRP復合物(cholera toxin subunit B conjugated with HRP，CB-HRP)兩種方法進行了比較。由于HRP可自由通過腦脊液-腦屏障，擴散至腦實質，應用HRP順行法標記CSF-cNs很難得出科學的結論。因此，尋求一種只標記CSF-cNs的示蹤劑至關重要。CB-HRP是一種酶標配體示蹤劑，其注入側腦室后僅局限于腦室系統，不能自由通過血-腦屏障進入腦實質，只可被具有遠端延伸的CSF-cNs終末吸收，標記效果優于HRP。因此，早期應用CB-HRP標記CSF-cNs來探索其起源、生長發育、功能是可行的。此外，CSF-cNs還可以通過GATA2和GATA3的表達來鑒定。

3.2CSF-cNs的特異性標志物雖然用CB-HRP標記CSF-cNs是可行的，但仍缺乏識別這些細胞的特異性標志物。Huang等[21]通過建立PKD2L1表達增強綠色熒光蛋白轉基因小鼠，意外發現CSF-cNs中存在PKD2L1離子通道，這一發現為CSF-cNs的后續研究提供便利并成為研究新熱點。PKD2L1是“瞬時受體電位”超家族中多囊藻毒素亞型的成員，是形成高電導的非選擇性陽離子通道，其活性受電壓、鈣、質子、細胞外pH值和滲透壓等影響[22]。多囊藻毒素通道存在于各種組織中，包括睪丸、腎臟和視網膜，也存在于腦組織和脊髓中。PKD2L1最初在小鼠出生后P1～P4階段脊髓的CSF-cNs中被發現[21]，Djenoune等[18]研究了PKD2L1在小鼠脊髓中的表達，在胚胎發育第14.5天時，頸髓中可見少量PKD2L1+細胞；從胚胎發育第16.5天開始，定位于中央管周圍的PKD2L1+細胞呈典型的CSF-cNs形態，胞體通常位于室管膜下，在成年小鼠中也如此；并通過檢測小鼠、獼猴和斑馬魚等脊椎動物CSF-cNs中PKD2L1的表達，證明了PKD2L1是脊椎動物共享的CSF-cNs的特異性標志物。雖然腦中多囊藻毒素通道的確切功能尚不清楚，但它們通常與細胞外信號的感覺整合有關，在一些組織中被認為是機械感受器[23-24]和化學感受器[11,25]。由于CSF-cNs的特殊位置，它可能具有檢測腦脊液化學和機械信號的功能，與之前CSF-cNs參與腦脊液穩態調節的假設相一致。Orts-Del′Immagine等[26]利用膜片鉗法對野生型和突變型PKD2L1小鼠腦干切片中的CSF-cNs進行膜片鉗全細胞記錄，證明了CSF-cNs自發激活的單一電流是由PKD2L1通道引起，因此PKD2L1可能有助于CSF-cNs細胞的激活，并成為這些特殊神經元的重要興奮性輸入。另外，CSF-cNs可以通過激活PKD2L1和酸敏感離子通道(acid-sensing ion channel，ASIC)來區分周圍環境的堿化和酸化[26]。

4 CSF-cNs的功能

4.1分泌功能根據對CSF-cNs超微結構的觀察，有學者提出，CSF-cNs胞體和樹突可基于包含突觸小泡和致密囊泡的軸突末梢組成神經分泌系統，這些末梢通過半橋粒附著在神經組織外表面的基底層上并聚集突觸小泡，因此CSF-cNs通過頂端延伸至脊髓中央管接收腦脊液信號，并將這些信號轉化為神經分泌輸出，通過軸突傳達出去[27-28]。研究表明，不同物種中不同區域CSF-cNs可釋放不同的神經遞質，如尾加壓素[29]、γ-氨基丁酸[7]、5-羥色胺[30]等。CSF-cNs通過分泌神經遞質向大腦及脊髓動態傳遞信號，并調節神經系統的活動及發育。

4.2感知功能 CSF-cNs呈雙極細胞形態，其樹突可進入腦室系統，樹突的末梢常有纖毛，這些帶有纖毛的末端與已知的感知細胞相似，在細胞學上類似于化學感受器和機械感受器。Desban等[31]研究發現，CSF-cNs可感知腦脊液中pH值和滲透壓的變化，以及腦脊液流量[32]或脊柱彎曲相關的機械刺激[33]。

4.2.1感知酸堿平衡酸堿平衡對于生物體的生存至關重要。研究表明，表達生長抑素/γ-氨基丁酸的CSF-cNs可感受細胞外pH值的雙向偏離。Jalalvand等[34]將堿性和酸性的細胞外溶液應用于小鼠分離的脊髓，同時對CSF-cNs進行電流和電壓鉗記錄。當細胞外液pH值降低或升高時，CSF-cNs中內向電流顯著增加，應用ASIC3阻斷劑APETx2(海藻毒素)后，阻斷了對酸性的反應但不影響堿性反應。在堿性pH值下，他們記錄了單一的內向電流，大小約為15 pA，與PKD2L1通道的大電導一致。根據不同pH值下對CSF-cNs細胞尖峰活性的記錄發現，脊髓中CSF-cNs分別通過ASIC3和PKD2L1通道檢測pH值的酸性和堿性偏差，導致動作電位的去極化和放電增加，并在pH值7.4附近呈U型反應[34]。為了研究下丘腦中CSF-cNs堿性pH值的通道類型，Jalalvand等[35]進行了PKD2L1的原位雜交(不存在特定PKD2L1的阻斷劑)，結果發現下丘腦CSF-cNs并不表達PKD2L1，提示PKD2L1不是下丘腦CSF-cNs的堿性感受器。而連接蛋白半通道作為候選通道即使在沒有與相鄰細胞偶聯的情況下也可以存在于CSF-cNs的細胞膜上，被認為是可以感知堿性pH值的候選分子。生長抑素陽性的下丘腦CSF-cNs對連接蛋白35/36呈免疫反應，應用阻斷劑三氯化鑭，可完全阻斷CSF-cNs對堿性pH值的反應，表明下丘腦生長抑素陽性CSF-cNs的堿性反應是通過連接蛋白半通道介導。CSF-cNs這一功能可能代表了一種新的穩態機制，從而構成中樞神經系統固有的反饋調節系統，可能對pH值變化引起的損傷起保護作用。

4.2.2感知流體運動和光學信號 ASIC3除了在細胞外pH值適度降低時可被質子活化，還可以作為機械傳感器，感知流體運動。感覺系統對于引導對稱生長和運動回路的平衡激活至關重要，但它們也可能與形態發生有關。研究已證明，CSF-cNs能調節控制運動和主動姿勢的脊髓回路[36]。有學者在斑馬魚幼體中發現，Reissner纖維與腹側和背側CSF-cNs的纖毛和微絨毛緊密相連，兩者在功能上相互作用，以檢測脊椎動物的脊柱彎曲[13,29]。此外，CSF-cNs也可作為光感受器發揮作用。下丘腦側葉腦室旁器官中的CSF-cNs對光敏感，可能參與鳥類季節性繁殖的調節[37]。

4.3神經干細胞功能在低等脊椎動物中，脊髓中央管周圍區域是神經發生的活躍部位，存在具有前體樣細胞和未成熟神經元功能特性的細胞[38]。哺乳動物中，CSF-cNs在形態上是接觸腦脊液最簡單的神經元類型，其胞體位于室管膜或室管膜下，具有單個頂端投射的樹突樣突起[23]。新生小鼠中，它既可表達成熟神經元標志物也可表達未成熟神經元標志物[39-40]。因此，CSF-cNs在成熟哺乳動物發育過程中處于低分化狀態，具有不成熟神經元特性，可能為內源性神經干細胞來源之一?；谝酝P于CSF-cNs具有不成熟神經元特性及室管膜區存在多分化潛能的內源性神經干細胞的研究，He等[41]利用霍亂毒素亞單位B-皂苷靶向毀損CSF-cNs后發現，其可加速內源性神經干細胞的增殖，提示CSF-cNs對脊髓損傷后內源性神經干細胞增殖過程有一定影響；同時他們在體外培養CSF-cNs，利用其特異性標志物PKD2L1標記、鑒定CSF-cNs，發現PKD2L1+CSF-cNs不僅可在體外增殖，而且可以形成具有傳代能力的神經球。Wang等[9]發現，CSF-cNs可在體外表達巢蛋白及轉錄因子性別決定區Y框蛋白2等神經干細胞標志物；貼壁誘導分化后，可在體外表達神經元核抗原、膠質纖維酸性蛋白、少突膠質細胞抗體等神經干細胞分化的標志物，說明CSF-cNs具有神經干細胞特征，可能參與脊髓損傷后的內源性修復。

4.4調節運動和信息傳遞研究顯示，激活CSF-cNs可以誘導斑馬魚幼蟲的運動，表明CSF-cNs可以為脊髓運動中心模式發生器提供直接輸入[42]。研究發現，CSF-cNs和尾部初級運動神經元亞群之間存在直接聯系[43]，CSF-cNs對慢速和快速運動中樞模式發生器進行門控和調節，從而控制運動事件的發生和持續時間。

Zhang等[44]通過電鏡觀察表明，中縫背核的CSF-cNs與腦實質的非CSF-cNs之間存在突觸聯系，形成軸-樹突觸或樹-樹突觸，在信息傳遞中發揮重要作用。這些突觸既有興奮性也有抑制性突觸，其共同特點是突觸前成分均為非CSF-cNs的結構，突觸后成分均為CSF-cNs的結構。在七鰓鰻中，CSF-cNs向腹側神經叢或腹外側緣發送神經突，在那里它們顯示末梢結構的神經支配，這使得信息可以在內部和外部腦脊液之間傳遞[28,45]。七鰓鰻的CSF-cNs似乎在腹側神經叢中接觸到邊緣細胞的脊髓內伸展感受器，這種感受器調節著運動神經網絡[45]。這一研究表明，CSF-cNs可能通過影響邊緣細胞來調節運動，從而影響運動相關的感覺反饋。

4.5參與疼痛信號轉導腦干被公認為是整合下行調節系統的關鍵部位，下行調節系統抑制和促進脊髓水平的疼痛。遠位CSF-cNs簡稱觸液核，主要分布于導水管下部腹側灰質和第四腦室底板上部腹側灰質內。研究表明，觸液核可能與疼痛信號的轉導和調節密切相關，在不同疼痛條件下，觸液核的c-Fos、5-羥色胺及受體、M8型瞬時受體電位通道和胞外信號調節激酶等10余種神經活性物質的表達可發生變化，但其具體機制尚不清楚[11]。Song等[6]將逆行示蹤劑霍亂毒素亞單位B注射入大鼠標記觸液核，證明CSF-cNs在大腦與腦脊液的聯系中起關鍵作用，且觸液核接受來自下丘腦室旁核、視上核、A11多巴胺細胞的輸入并可能參與痛覺調制[46-49]。目前對于生物疼痛機制尚不清楚，觸液核作為聯系腦實質及腦脊液的紐帶，在參與疼痛反應中發揮級聯調節作用，其作用機制可能會為研究新型鎮痛藥提供新靶標。

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