微波輔助提取辣木葉總黃酮工藝優化及其抑菌和抗氧化活性研究

楊麗華 董曉倩 董啟露 李曉嬌

(保山學院資源環境學院，云南 保山 678000)

辣木(MornigaoleiferaLam.)為辣木科辣木屬的一種喬木，因其根有辛辣味而得名，辣木的根、葉和嫩果可以食用，種子含油，可作為潤滑油和定香劑[1]。辣木原產印度，近年來在中國云南、廣西、廣東、海南等地區均有引種[2]。辣木葉中富含多種營養成分和多種活性成分[2-5]，具有降血糖、抗氧化、抗癌、消炎抑菌、降血壓和降膽固醇等作用[5-9]，于2012年被批準為新資源食品。目前，已從辣木黃酮類中分離鑒定出蘆丁、多花薔薇苷、牡荊素、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-丙二酰基己糖苷、異鼠李素、芹菜素、表兒茶素等多種黃酮類化合物，這些物質多以苷類形式存在[8-11]。

目前，應用于辣木總黃酮提取的方法有溶劑浸提法[12]、超聲波輔助提取法[12-17]、微波輔助提取法[18]、酶解提取法[19]、亞臨界流體萃取法[20]和常壓內部沸騰法[21]等，其中以溶劑浸提和超聲波輔助提取的報道較多。張善添等[12]采用加熱回流水提、加熱回流水提醇沉、70%乙醇加熱回流提取、超聲加熱水提、超聲加熱醇提、超聲醇提等方法提取辣木葉中的總黃酮，得率分別為1.57%，1.82%，3.25%，1.91%，3.21%，2.64%；吉莉莉等[18]用乙醇浸提和微波輔助法提取辣木葉總黃酮，得率分別為2.60%，3.45%；張展適等[22]利用超聲波輔助法的得率僅為0.84%；上述提取率較低，且關于辣木葉總黃酮抑菌活性的報道較少。王遠[10]研究表明，辣木葉總黃酮的抑菌效果為大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌；馬金魁等[14]研究表明，辣木葉總黃酮的抑菌效果為白色假絲酵母>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌；王麗虹等[23]研究表明，辣木葉總黃酮對枯草芽孢桿菌的抑制作用強于金黃色葡萄球菌，對大腸桿菌則無抑制作用；以上試驗結果差異較大。

微波產生的高頻電磁波可以加速細胞破裂，促進細胞內黃酮類物質的流出，所以微波輔助提取能縮短提取時間、提高提取效率、減少溶劑消耗，并減少活性物質結構的破壞[24-25]。研究擬利用響應面法優化微波輔助提取工藝，采用濾紙片法測定辣木葉總黃酮對3種供試菌種的抑菌能力，并考察其體外抗氧化活性，旨在為辣木葉總黃酮的高效提取及進一步研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉：2020年8月采摘于保山市潞江壩，經保山學院汪建云教授鑒定為辣木科辣木屬植物辣木(MornigaoleiferaLam.)；

大腸桿菌(Echerichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)：保山學院微生物實驗室；

蘆丁標準品：德國Dr. Ehrenstofer Gmbh公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；

牛肉膏：廣東環凱微生物有限公司；

蛋白胨：北京奧博星生物科技有限責任公司。

1.2 儀器和設備

高速萬能粉碎機：DFY-800型，杭州旭朗機械設備有限公司；

微波爐：MW20-M605型，格蘭仕微波爐電器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV5000型，安徽皖儀科技有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-4型，上海一恒科學儀器有限公司；

循環水式多用真空泵：雙A型，鄭州長城科工貿有限公司；

旋轉蒸發儀：N-1001型，上海泉杰儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-758KB型，上海申安醫療器械廠；

恒溫振蕩培養箱：SPX型，波東南儀器有限公司；

冷凍干燥儀：ZX-LGJ-IA型，上海知信實驗儀器技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的建立 參照王遠[10]的方法，得到線性回歸方程y=9.55x+0.000 3，R2= 0.999 4。

1.3.2 辣木葉總黃酮提取 將辣木葉陰干后粉碎，過60目篩。稱取適量辣木葉粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，回流提取2 h，抽濾烘干后即得辣木葉脫脂粉末。精確稱取1.00 g辣木葉脫脂粉末進行微波輔助提取。

1.3.3 單因素試驗 設定料液比為1∶25 (g/mL)，微波功率為406 W，微波時間為4 min，乙醇體積分數為50%，固定其他條件，分別考察料液比、微波功率、微波時間、乙醇體積分數對辣木葉總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計響應面試驗。

1.3.5 辣木葉總黃酮含量測定 移取提取液1.0 mL，測定510 nm處吸光度，重復3次，按式(1)計算總黃酮含量。

(1)

式中：

X——辣木葉總黃酮提取率，%；

C——總黃酮質量濃度，mg/mL；

V1——定容體積，mL；

V2——顯色反應時定容體積，mL；

m——辣木粉質量，g；

V0——吸取提取液體積，mL。

1.3.6 抑菌活性測定 參照楊麗華等[26]的方法。

1.3.7 抗氧化活性測定

(1) DPPH·清除能力：參照楊麗華等[26]的方法。

(2) ABTS+·清除能力：參照岳秀潔等[17]的方法。

(3) ·OH清除能力：參照王娟等[27]的方法。

1.3.8 數據處理 各試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析和IC50值計算，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析響應面試驗數據。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1可知，隨著料液比、微波功率、微波時間和乙醇體積分數的升高，辣木葉總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢。這是因為隨著料液比的增加，辣木葉粉末與溶劑的接觸更充分，總黃酮提取率逐漸提高，但料液比增大到一定程度后，總黃酮已基本溶出，再增加料液比會導致其他可溶性雜質與黃酮類化合物競爭溶劑，導致提取率下降[17，28]。微波功率較低、微波時間過短時，總黃酮溶出不完全，反之則會破壞黃酮類化合物的結構[28-29]。乙醇體積分數的增加會造成溶劑的極性下降，乙醇體積分數較低時會導致水溶性物質溶出，乙醇體積分數過高時會導致脂溶性成分溶出，從而降低辣木葉總黃酮提取率[30]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選擇料液比、微波功率、微波時間和乙醇體積分數為因素，以辣木葉總黃酮提取率為響應值進行響應面試驗優化，各因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

采用Design-Expert 8.0.6.1進行分析，得到辣木葉總黃酮提取率與各因素的回歸方程模型為：

Y=7.32-0.23A-0.046B-0.073C-0.045D+0.071AB+4.250E-003AC-0.09AD+4.656E-003BC-3.938E-004BD+0.052CD-0.20A2-0.22B2-0.099C2-0.34D2。

(2)

由表3可知，模型P<0.000 1，極顯著，失擬項P=0.534 4>0.05，不顯著，表明所得回歸方程擬合較好，回歸性顯著。模型中A、C、A2、B2、C2、D2對響應值的影響極顯著(P<0.01)，B、D、AD對響應值的影響顯著(P<0.05)。各因素對響應值的影響從大到小依次為料液比>微波時間>微波功率>乙醇體積分數。

表3 Box-Behnken試驗結果方差分析?

根據響應面分析得到最佳工藝條件為料液比1∶28.84 (g/mL)、微波功率521.88 W、微波時間3.61 min、乙醇體積分數49.86%，此條件下辣木葉總黃酮提取率預測值為7.411%。為了便于操作，將最佳提取工藝調整為料液比1∶29 (g/mL)、微波功率567 W、微波時間3.6 min、乙醇體積分數50%，此條件下辣木葉總黃酮實測提取率為(7.414±0.027)%，與理論值接近，說明模型擬合良好，工藝合理可行。

研究[31-33]表明，辣木葉中的營養成分含量與品種、產地、采收時期和樣品干燥方式等密切相關，試驗中辣木葉總黃酮的提取率高于前人[10,12-13,15-20,22]，可能與辣木葉的產地、干燥方式、采收時期和提取條件等有關。

2.3 抑菌活性

抑菌圈直徑大小可以反映供試菌種對總黃酮的敏感程度，參照藿歸國等[34]的方法可劃分為高度敏感(直徑>20 mm)、敏感(直徑14～20 mm)、中度敏感(直徑8～14 mm)和不敏感(直徑<8 mm[30])。由表4可知，辣木葉總黃酮對3種供試菌種的抑菌活性有顯著差異(P<0.05)，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對辣木葉總黃酮中度敏感，金黃色葡萄球菌對辣木葉總黃酮不敏感。辣木葉總黃酮提取液對枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳，抑菌圈直徑為(10.64±0.04) mm，顯著高于大腸桿菌，對金黃色葡萄球菌基本無抑制效果。

表4 辣木葉總黃酮的抑菌圈直徑?

研究[35]表明，黃酮類化合物具有較強的抑菌活性，如槲皮素-3-O-葡糖苷及各種槲皮素苷、山奈酚及其衍生物、芹菜素、兒茶素等具有抑菌作用，這些化合物已在辣木葉總黃酮中被鑒定出[9-11]。王麗虹等[23]研究表明，辣木葉醇提物及其乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用。郭妍等[11]研究表明，5～500 μg/mL的辣木葉黃酮對金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，對大腸桿菌無抑制效果。馬金魁等[14]研究表明，辣木葉總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較好的抑制效果，抑菌圈直徑分別為(17.30±0.01)，(16.20±0.10)，(12.50±0.10)mm。王遠[10]研究表明辣木葉總黃酮的抑菌效果受到純化與否及辣木葉總黃酮質量濃度的影響。以上結果與試驗結果有差異，可能與辣木葉總黃酮溶液的質量濃度以及黃酮類單體成分的組成不同有關。

2.4 抗氧化活性

由圖2可知，隨著提取物質量濃度的增大，DPPH·和ABTS+·的清除率逐漸上升，但均低于相同質量濃度的抗壞血酸。當樣品質量濃度為0.02～0.10 mg/mL時，隨著辣木葉總黃酮質量濃度的增加，其對·OH的清除率幾乎呈線性上升。當辣木葉總黃酮質量濃度為0.02～0.06 mg/mL時，其對·OH的清除率低于同質量濃度的抗壞血酸，當辣木葉總黃酮質量濃度>0.08 mg/mL時，其對·OH的清除率高于抗壞血酸，說明高濃度的提取物對·OH的清除效果較好。抗壞血酸對DPPH·、 ABTS+·和·OH的IC50值分別為0.007，0.001，0.047 mg/mL，而辣木葉總黃酮對應的IC50值分別為0.024，0.014，0.051 mg/mL，分別為抗壞血酸的3.43，14.00，1.09倍。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

通過Box-Behnken中心組合設計四因素三水平的響應面試驗，得到微波輔助提取辣木葉總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶29 (g/mL)、微波功率567 W、微波時間3.6 min、乙醇體積分數50%，此條件下辣木葉總黃酮提取率為(7.414±0.027)%。與傳統的溶劑浸提相比，試驗方法具有提取時間短、提取率高的特點。抑菌活性試驗結果表明，辣木葉總黃酮對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有不同程度的抑菌作用，屬于中度敏感，對金黃色葡萄球菌幾乎無抑制作用。抗氧化試驗結果表明，辣木葉總黃酮對體外DPPH·、·OH、ABTS+·清除的半抑制濃度分別為0.024，0.051，0.014 mg/mL，說明其具有較強的抗氧化活性。試驗所選取的供試菌種和抗氧化方法較少，對辣木葉總黃酮的抑菌和抗氧化活性評價還不夠全面，后續應選用更多的菌種和不同原理的抗氧化方法進行試驗，并對抑菌和抗氧化活性的機理進行探索。此外，不同的黃酮類化合物單體的抑菌和抗氧化能力不同，多種黃酮類化合物單體聯用會形成協同或拮抗作用。試驗中的辣木葉總黃酮為粗提物，具體的黃酮類單體成分及含量尚不明確，還需進一步研究。