痛風片提取與成型工藝的優化

姜墾 包旭宏 劉海龍 路杰 張宇

痛風（Gout）是單鈉尿酸鹽晶體（Monosodium urate，MSU）沉積在關節周圍所致的一種炎癥，與代謝性疾病高尿酸血癥息息相關[1]。據統計[2]，我國痛風發病率為0.86%～2.20%，其中男性患病率遠高于女性，并呈逐年增長趨勢。目前痛風的治療重點在于控制尿酸水平，主要包括減輕炎癥反應、促進尿酸排泄或抑制尿酸生成[3]。

藏醫藥是祖國傳統醫學中的一顆明珠，其有效性已得到越來越多人的認可，藏醫藥干預痛風以分期論治思想結合病癥特點取得了良好效果[4]。痛風片由獨一味、決明子、訶子、寬筋藤、黃葵子等八味藏藥材組成，是蘭州市奇正中藏醫醫院的經驗方，具有祛風止痛、清熱利濕的功效，用于濕熱瘀阻所致的痛風病。本實驗采用正交實驗結合信息熵理論優化痛風片的提取工藝，星點設計-效應面法結合總評歸一法（OD）優化痛風片的成型工藝，以期為痛風片新藥的開發奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）、旋轉蒸發儀（瑞士步琪）、立式超純水機（MOLgene120d，甘肅摩勒科學有限公司）、電子天平（YP-2001N，上海精密科學儀器有限公司）；分析天平（XS205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、高效液相色譜儀（Agilent 1260，安捷倫科技（中國）有限公司）、BJ-Ⅱ崩解時限儀（天津市光學儀器廠）、PYD-Ⅰ型片劑硬度測試儀（天津市藍深科技發展有限公司）、CSD-Ⅱ型脆碎度檢測儀（天津市藍深科技發展有限公司），ZPY-9型10沖旋轉式壓片機（青州市精誠醫藥裝備制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 獨一味（批號20210428-02）、黃葵子（批號180601）、寬筋藤（批號20030034）、決明子（批號180401-1）、車前子（批號202003001）、訶子（批號2007211）等藥材均來源于甘肅奇正藏藥有限公司，山梔苷甲酯對照品（批號111873-202004）、8-O-乙酰山梔苷甲酯對照品（批號111872-201703）均來源于中國食品藥品檢定研究院。

淀粉、微晶纖維素、糊精、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂、交聯聚維酮均為藥用規格；乙腈為色譜純[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；其他均為分析純（成都市科隆化學品有限公司）；水為純化水。

2 方法

2.1 山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫Ecplise Plus C18柱（4.6×250mm，5.0μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10min，8%→10%A；10～25min，10%A；25～29min，10%→14%A；29～45min，14%→16%A；45～55min，16%→20%A；55～60min，20%→80%A）流速為1ml/min，檢測波長235nm，柱溫30℃，進樣量為10μl。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定山梔苷甲酯對照品10.64mg、8-O-乙酰山梔苷甲酯對照品11.04mg置于25ml容量瓶中，以色譜甲醇溶解定容，搖勻，超聲處理作為山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯對照品儲備液。取儲備液10、5、2、1、0.5、0.2ml分別定容至10ml容量瓶中，超聲、搖勻，得到不同濃度的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱定1g水提濃縮液真空干燥物，精密移取25ml 70%甲醇，水浴加熱回流1h，放冷，用70%甲醇補足失重，用0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液，即可獲得供試品溶液。

2.1.4 陰性供試品溶液制備 對不含獨一味藥材的痛風片處方加8倍水回流提取3次，每次0.5h，合并濾液，減壓濃縮至100ml，真空干燥，粉碎至過4號篩，按“2.1.3”項下方法制備缺獨一味的陰性對照品溶液。

2.1.5 專屬性實驗 精密吸取上述供試品溶液、混合對照品溶液、陰性供試品溶液各10μl，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，色譜圖見圖1，結果陰性無干擾，表明專屬性良好。

圖1 痛風片提取液中山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯高效液相色譜圖

2.1.6 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液10μl，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，以對照品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，見表1。表明2種指標成分在各自濃度范圍內線性關系良好。

表1 2種成分線性關系考察結果

2.1.7 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下32.89μg/ml的山梔苷甲酯與31.90μg/ml的8-O-乙酰山梔苷甲酯對照品溶液，連續進樣6次，計算峰面積的RSD。結果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為0.14%、0.30%。

2.1.8 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液室溫放置，分別于0、2、4、6、8、12、24h精密吸取10μl進樣分析，結果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為2.40%、1.43%。

2.1.9 重復性試驗 按“2.1.3”項下方法制備6份供試品溶液進行測定，結果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為0.58%、1.99%。

2.1.10 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品溶液，分別加入山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯對照品適量，進樣分析，計算供試品在低、中、高濃度下山梔苷甲酯的平均回收率分別為104.09%、102.32%和101.54%；8-O-乙酰山梔苷甲酯的平均回收率為94.13%、97.02%和98.95%。

2.2 干膏得率的測定 取90g痛風片配方藥材，加適量水煎煮，將回流提取水煎液濃縮、定容至100ml容量瓶中，精密量取25ml置入已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后于105℃烘箱中干燥3h，取出放于干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量，計算干膏得率。干膏得率（%）=（含干膏蒸發皿質量-蒸發皿質量）×20/100×100%[5]。

2.3 提取工藝考察

2.3.1 吸水率考察 取處方量飲片3份，每份90g，置于干燥燒杯中，加入500ml蒸餾水，封口，浸泡至藥材無白心，稱定濕重，計算平均吸水率為206%。吸水率=（濕藥材重量-干藥材重量）/干藥材重量×100%。

2.3.2 正交實驗設計 基于傳統水煎工藝，選擇以水為提取溶劑，經單因素實驗確定加水量以原藥材的8、10、12倍，提取時間為0.5、1、1.5h，提取次數選擇1、2、3次進行正交實驗設計，擬定L9（34）正交表進行實驗，以山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯的含量、干膏得率為評分指標，采用熵權法對評價指標進行權重系數分配，計算綜合評分，確定最佳提取工藝，因素水平見表2。

表2 痛風片提取工藝正交實驗因素水平表

2.3.3 正交實驗數據處理 權重分析是通過熵權法對各指標的重要性進行權重輸出，根據信息熵的定義，對于某項指標，可以用熵值來判斷離散程度，其信息熵值越小，指標的離散程度越大，該指標對綜合評價的影響（即權重）就越大，因此，可利用信息熵這個工具，計算出各個指標的權重，為多指標綜合評價提供依據[6，7]。通過計算，結果見表3。

表3 痛風片提取工藝評價指標權重

根據各指標的權重系數對正交實驗數據進行綜合評分。綜合評分=山梔苷甲酯含量/山梔苷甲酯含量最大值×0.2876×100+8-O-乙酰山梔苷甲酯含量/8-O-乙酰山梔苷甲酯含量最大值×0.3484+干膏得率/干膏得率最大值×0.3639。正交實驗見表4，利用方差分析確定最優提取工藝，見表5。

表4 痛風片提取工藝正交實驗結果

表5 痛風片提取工藝正交實驗結果方差分析

由正交實驗結果直觀分析得到各因素對痛風片水提工藝最主要因素為煎煮次數（C），其中加水倍數（A）和煎煮時間（B），各因素不同水平影響為A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1（其中數字代表因素所對應的水平）。經方差分析發現因素3（提取次數）各水平間差異具有統計學意義（P<0.05），根據實驗結果及生產實際確定最佳提取工藝水平組合為A1B1C3，即加8倍量水煎煮3次，每次0.5h。

2.3.4 實驗驗證 稱取處方藥材90g，共3份，按“2.3.2”至此項下的優化工藝進行3批實驗驗證，見表6，表明該工藝穩定可行。

表6 痛風片提取工藝驗證結果

2.4 成型工藝研究

2.4.1 片芯制備方法的確定 稱取處方藥材，加8倍量水煎煮3次，每次0.5h，過濾，合并濾液，噴霧干燥得到浸膏粉，將本品與填充劑過60目篩3遍混合均勻，加入適量的潤濕劑制軟材，過20目篩擠壓制得顆粒，40℃烘干，整粒后與崩解劑和潤滑劑混合均勻，即可獲得片芯。

2.4.2 填充劑的選擇 本品具有吸濕性，長期放置會出現結塊現象，選擇合適的輔料可以改善主藥的吸濕性質，常見的輔料有糖類、淀粉類、纖維素類等。痛風患者常伴有高血壓、高血糖等疾病，不宜選擇糖類為填充劑，本實驗選擇淀粉、糊精、微晶纖維素作為制劑的填充劑，按照“2.4.1”項的方法制備片芯，考察不同片芯制得片劑的硬度、脆碎度和崩解時限，見表7。

表7 填充劑篩選結果

實驗結果表明，當以糊精、淀粉為填充劑時，脆碎度檢測時會出現碎片現象，以微晶纖維素為填充劑時各項均合格，考慮到微晶纖維素價格較高，在微晶纖維素中加入淀粉還能降低脆碎度，故選定微晶纖維素和淀粉為填充劑。

2.4.3 崩解劑的選擇 由于中藥浸膏片崩解時間較長，故需要加適宜的崩解劑促進崩解。本實驗在保持其他輔料不變的情況下，選擇羧甲基淀粉鈉和交聯聚維酮作為崩解劑篩選[8]，見表8。

表8 崩解劑篩選實驗結果

實驗結果表明，以羧甲基淀粉鈉為崩解劑時脆碎度與硬度均好于交聯聚維酮，所以選擇以羧甲基淀粉鈉為崩解劑。同時考察崩解劑的加入方法，發現外加法得到的片劑硬度及碎度均合格，且崩解時限最短，綜合考慮選擇操作較易的外加法做為崩解劑的加入方法。見表9。

表9 崩解劑加入方法實驗結果

2.4.4 潤濕劑的選擇 本品為中藥浸膏粉片，具有較強的粘性和吸濕性，在預實驗中發現只需要加入潤濕劑，顆粒就具有良好的成型性，經預實驗確定95%乙醇為潤濕劑。

2.4.5 潤滑劑的選擇 硬脂酸鎂表面積大、易與顆粒混合，粘附性強，使片劑光滑美觀，在片劑中作為潤滑劑和抗粘劑廣泛使用[9]，考察用量對本品休止角、硬度、脆碎度及崩解時限的影響，見表10。可知潤滑劑用量對休止角和硬度無明顯影響，延長崩解時間，故本實驗選擇0.2%硬脂酸鎂作為潤滑劑。

表10 潤滑劑篩選

2.4.6 星點實驗設計優化片劑處方 在單因素實驗篩選的基礎上，選擇對制劑影響較大的微晶纖維素（MCC）、淀粉、羧甲基淀粉鈉（CMS-Na）的用量作為影響因素，以脆碎度（d1）、硬度（d2）、休止角（d3）和崩解時限（d4）的OD值為評價指標[10]，計算公式為OD=（d1×d2×d3×d4）1/4。對于越大越好的指標（如硬度）dn=（Yn-Ymin）/（Ymax-Ymin）；對于越小越好的指標（如脆碎度、休止角和崩解時限）dn=（Ymax-Yn）/（Ymax-Ymin），實驗設計因素水平見表11，實驗結果見表12。

表11 實驗設計因素水平

2.4.7 模型擬合與方差分析 采用Design-Expert10.0.1軟件對表12數據進行擬合，得到方程為OD=-2.2115+4.0075A+3.7602B+0.1881C-4.48-42AB+0.0467AC-0.0479BC-0.5007A2-1.4424B2-0.0094C2，方差分析見表13。

表12 實驗設計與結果

表13 方差分析

2.4.8 效應面優化與預測 利用Design Expert10.0.1軟件得到輔料與浸膏粉比例、淀粉與微晶纖維素比例、崩解劑用量各因素交互OD值的效應面圖，見圖2。在實驗設計的各比例范圍內，通過Design Expert10.0.1軟件得到痛風片最佳成型工藝：輔料與浸膏粉比例為0.42：1，淀粉與微晶纖維素比例為0.88：1，崩解劑用量為8.29%，OD值為0.7513。結合實際生產操作，將最優成型工藝調整為輔料與浸膏粉比例為0.4：1，淀粉與微晶纖維素比例為0.85：1，崩解劑用量為8%。

圖2 3種因素交互OD值的效應面圖

2.4.9 實驗驗證 按優化最佳工藝制備3批痛風片進行驗證試驗，見表14。由此可知，OD值為0.7260，與預測值的OD值（0.7513）接近，表明模型預測性良好，可用于工藝參數的優化。

表14 實驗驗證

3 討論

近年來，藏醫藥理論發展迅速，其中藏成藥在抗痛風方面取得了顯著成就。痛風片具有祛風止痛、清熱利濕的功效，用于濕熱瘀阻所致的痛風病。本方中所含藥物較多，煎煮過程中加水量、煎煮時間和煎煮次數等因素都會對復方提取液中活性成分的含量有影響，本實驗通過熵權法對多指標成分賦權，得到綜合評分，從而篩選最佳提取工藝。

臨床療效是由復方中多種活性成分共同發揮作用的結果，因此評價指標的選擇是提取工藝中的重要一環，本實驗以痛風片復方中的君藥獨一味的有效成分與干膏得率為優化指標，朱斌[11]研究發現獨一味水提物能夠有效抑制慢性疼痛，馬文玉等[12]認為獨一味鎮痛有效物質是環烯醚萜苷類化合物山梔苷甲酯與8-O-乙酰山梔苷甲酯。干膏得率對后續片劑的成型工藝及服用劑量有極大影響，因此本實驗選擇山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯和干膏得率為評價指標。

中藥片劑的成型是個較為復雜的過程，提取物干膏粉的粉體學性質、輔料的種類、制粒方法等[13]均會影響到片劑最終的成型。本方采用水提法，噴霧干燥得到的干膏粉粘性強、流動性差、易吸濕，直接壓片不易成型，需要加入適宜的稀釋劑和助流劑進行制粒、壓片。本實驗采用濕法制粒，在預實驗中發現以75%、85%的乙醇為潤濕劑制軟材時易形成團塊，出現“死顆粒”，無水乙醇制粒成本較高且干粉較多，最終選擇以95%乙醇制粒。在填充劑的選擇方面主要以微晶纖維素和淀粉的比例進行篩選。中藥浸膏片通常不易崩解，本實驗以硬度、脆碎度和崩解時限為指標考察羧甲基淀粉鈉和交聯聚維酮的崩解作用，并確定外加法為崩解劑的加入方法。最后選擇對制劑影響較大的輔料用量、微晶纖維素和淀粉的比例、羧甲基淀粉鈉的用量進行三因素五水平的星點設計-效應面法實驗的考察，結果顯示擬合效果較好，經實驗驗證確認優化工藝穩定可行，重復性較好。但實驗室小試提取、成型工藝關鍵參數具有局限性，故今后進行中試，以期為痛風片的大規模生產提供重要依據。