低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害發生為害調查分析

李文鳳，李 婕，普家榮，王曉燕，單紅麗，張榮躍，普金安，李銀煳，黃應昆

（1云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南開遠 661699；2新平縣經濟作物工作站，云南新平 653400）

0 引言

云南地處低緯高原，在21°8′—29°15′N、97°31′—106°11′E 之間均有甘蔗種植，蔗區氣候和環境復雜多變[1]。加之甘蔗屬無性繁殖宿根性作物，多年來輪作區域少，長期連作，導致甘蔗病害日趨積累而加重；多種病原復合侵染，擴展蔓延迅速，甘蔗受損極為嚴重[2-3]。自2015 年以來多雨高濕加上感病品種規模化種植，導致甘蔗中后期災害性真菌病害在臨滄、玉溪、版納、普洱等低緯高原蔗區流行成災，減產減糖嚴重[4-5]。多數蔗區因防治不及時不到位，感病品種常出現大量蔗莖枯死，病株率60%～100%；甘蔗減產30%～48%；糖分降低2%～4%，經濟損失巨大[5-6]。因此，如何精準診斷和防控甘蔗中后期災害性真菌病害成為甘蔗產業高質量發展的重要任務。

甘蔗屬喜溫作物，大部分蔗區屬于熱帶、亞熱帶[1]，7—10 月多雨高溫高濕，甘蔗梢腐病、褐條病、銹病、葉焦病、褐斑病、黃點病、眼斑病、輪斑病等多種病害極易發生流行、并發為害[2,5]，尤以梢腐病、褐條病、銹病發生普遍、報道較多[5,7-8]。國內外研究表明甘蔗梢腐病菌種類繁多，目前已報道的有7種鐮刀菌[9-11]，不同國家和蔗區病菌種群及優勢種存在差異[12]，中國已確定的有5 種，優勢種為Fusarium verticillioides[13-15]；已報道的甘蔗褐條病菌多為平臍蠕孢屬Bipolaris[4,8]；根據癥狀和病原特征，甘蔗銹病菌有黑頂柄銹菌Puccina.MelanocephalaSyd.et P.Syd、屈恩柄銹菌Puccina.kuehniiButler 和黃褐銹菌Macruropyxis fulvasp.nov 3種[16-17]。目前，國內外關于甘蔗梢腐病的研究多為致病病原分離鑒定、病菌生物學特性及代謝產物測定[18-19]，少數對其發生為害情況、形態與品種抗性評價和防控等作了初步調查分析和探索[20-21]；對甘蔗褐條病的研究報道甚少，多是一些關于該病發生情況和防治上的初步調查研究[4,22-23]；就甘蔗銹病也多是病菌檢測鑒定、生物學特性和抗病基因標記開發與檢測[24-26]，少數對其發生為害情況、品種抗性和防控進行了初步調查[5,27-28]。

低緯高原云南蔗區是中國第二大甘蔗產區，甘蔗中后期災害性真菌病害逐年擴展蔓延加重危害，而有關低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害缺乏系統研究，病原類群與品種抗性不清、為害損失及致災因子不明，有效防控缺乏基礎和科學依據。為此，針對低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害大面積暴發為害和防控問題，云南省農業科學院甘蔗研究所牽頭糖企藥企開展科企合作、產學研結合，進行了系統的調查檢測與試驗研究，以期明確低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害種類、病原類群、為害損失及災害特性，為防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查及樣品采集

于2015—2020年7—10月發病期，分別對臨滄、玉溪、版納、普洱、紅河、保山、德宏、文山等低緯高原蔗區進行調查采樣，觀察并記錄病害癥狀。

甘蔗梢腐病隨機取3點，每點調查100株，記錄調查總株數、病株數，計算病株率，見公式(1)。

甘蔗褐條病和甘蔗銹病采用3 點取樣，每點調查20 株。參照楊子林等[29]和Comstock 等[30]的標準進行病情分級，其中，1級—葉片無癥狀；3級—病斑占葉面積0%～25%；5 級—病斑占葉面積26%～50%；7 級—病斑占葉面積51%～75%；9 級—病斑占葉面積76%～100%。

1.2 病原檢測鑒定

1.2.1 DNA 提取 取各待測病葉0.2 g，用植物基因組DNA 試劑盒提取DNA，用Eppendorf AG 22331 蛋白/核酸分析儀檢測提取DNA質量，-20℃保存備用。

1.2.2 甘蔗梢腐病病原分子檢測 采用基于核糖體DNA 非轉錄間隔區(rDNA-ITS)序列設計的F.verticillioides和F.proliferatum特異性引物，即Fv-F4/Fv-R4和Fp-F3/Fp-R3，委托上海生工生物技術有限公司合成，其序列為：Fv-F4：5'-TCG GGG CCG GCTT GCCGC-3'；Fv-R4：5'-TAC AAC TCC CAA ACC CCT GTG AAC ATA C-3'。Fp-F3：5'-GTTT TAC TAC TAC GCTATG GAA GCT-3'；Fp-R3：5'-CGA GTT TAC AAC TCC CAAACC CCT-3'。預期擴增產物長度為400 bp。25 μL 反應體系為：DNA 2 μL、TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各2.5 μL (10 μmol/L)，滅菌ddH2O 5.5 μL。PCR 擴增程序為：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，63℃退火15 s，72℃延伸30 s，30 個循環；最后72℃延伸10 min。電泳檢測擴增產物，陽性克隆經PCR鑒定后送華大基因測序。登錄Genbank對所得序列進行BLAST檢索，利用DNAMAN v6.0軟件進行核苷酸序列一致性分析。根據比對結果從GenBank數據庫獲得其他甘蔗梢腐病病原菌的rDNA-ITS 序列，應用MEGA 6.0 軟件構建系統進化樹，采用Neighbor-Joining 法建樹，模式選擇Kimura 2-parameter，自舉檢測(bootstrap)重復1000 次，以甘蔗黑穗病菌Sporisorium scitamineum（GenBank 登錄號：EF185083）為外群。

1.2.3 甘蔗褐條病病原分子檢測 分別用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行ITS序列PCR擴增，引物gpd1(CAACGGCTTCGGTCGCATTG)和gpd2(GCCAAGCAGTTGGTTGTGC)進行GPDH 序列PCR擴增。25μL 反應體系：ddH2O 8μL、2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL (10 μmol/L)，DNA模板2.5μL。ITS和GPDH基因PCR擴增程序均為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。電泳檢測擴增產物，陽性PCR產物送華大基因測序。測序結果首先在NCBI 進行BLAST 檢索，與NCBI 上已知序列進行同源比對，然后用DNAMEGA 6.0 軟件進行序列分析并構建系統進化樹，確定其分類地位。

1.2.4 甘蔗銹病病原分子檢測 參照文獻[31]和[16]的方法進行銹病病原檢測、測序及系統進化分析，確定其分類地位。

1.3 甘蔗品種自然抗性調查

于2015—2020年7—10月發病期，分別對臨滄、玉溪、版納、普洱、紅河、保山、德宏等低緯高原蔗區主栽和主推品種新植/宿根病情進行調查。

甘蔗梢腐病每個品種隨機取3 點，每點順序調查100株有效蔗株，記錄總調查株數及病株數，計算自然病株率，見公式(3)。

參照國家糖料產業技術體系病蟲害研究室(2012)的劃分方法，并作修改，根據各品種自然病株率按1～5級分級標準進行甘蔗梢腐病自然抗性評價，具體為1級：病株率0%，高抗；2級：病株率0.1%～10.0%，抗病；3級：病株率10.1%～20.0%，中抗；4 級：病株率20.1%～40.0%，感病；5級：病株率40.1%～100.0%，高感。

甘蔗褐條病每個品種隨機取3 點，每點順序調查100 株有效蔗株病情。參照楊子林等[29]按1～6 級分級標準進行自然抗性評價，具體為1 級：葉片無病斑，高抗；2 級：病斑占葉面積＜10%，抗病；3 級：病斑占葉面積11%～25%，中抗；4 級：病斑占葉面積26%～40%，中感；5 級：病斑占葉面積41%～65%，感病；6 級：病斑占葉面積66%～100%，高感。

甘蔗銹病每個品種隨機取3點，每點順序調查100株有效蔗株病情，參照Costet 等[32]的評價方法按1～9級分級標準進行自然抗性評價。

1.4 甘蔗產量和糖分損失測定

于甘蔗成熟收獲期分別選擇為害區和未為害區采用3點取樣，每點66 m2，收砍稱量蔗莖產量，計算相對產量損失率。計算見公式(4)。

于甘蔗成熟期選擇為害區和未為害區采用3點取樣，每點隨機選取健株10株、病株10株，按中國甘蔗糖業標準化與質量檢測中心制定的二次旋光法，測定分析各樣品品質指標，按“損失量=未為害區-為害區”計算各指標損失量。

2 結果與分析

2.1 低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害種類及分布

通過對臨滄、玉溪、版納、普洱、紅河、保山、德宏、文山等主產蔗區調查分析，云南低緯高原蔗區甘蔗中后期災害性真菌病害主要有：甘蔗梢腐病、甘蔗褐條病、甘蔗銹病共3種，它們廣泛分布于云南低緯高原蔗區（表1）。其中，以甘蔗梢腐病暴發成災趨勢明顯，感病品種發病嚴重，平均病株率高達81.2%（表2），常使大量蔗莖枯死，是造成減糖減產最嚴重的第一大病害。

表1 3種甘蔗中后期災害性真菌病害地理分布

2.2 為害損失

3種甘蔗中后期災害性真菌病害發生情況調查及蔗莖產量和品質測定結果如表2。從表2可以看出，不同蔗區3 種病害發生為害程度不一、不同為害程度甘蔗產量損失和品質影響不一，受害蔗株的糖分、錘度、重力純度均顯著低于健康蔗株，還原糖則顯著高于健康蔗株。

表2 3種甘蔗病害為害對甘蔗產量和品質的影響

甘蔗梢腐病病株率為63.3%～95%，平均81.2%；甘蔗實測產量相對損失率為30.2%～48.5%，平均38.43%；甘蔗糖分減少2.63%～5.21%、平均3.54%；錘度降低2.4～4.69°BX、平均3.54°BX；重力純度降低1.99%～8.63%、平均5.37%，而還原糖則增加0.05%～0.6%、平均0.15%。

甘蔗褐條病病情指數為82.2～86.5，平均84.7；甘蔗實測產量相對損失率為19.0%～32.8%，平均25.6%；甘蔗糖分減少1.38%～3.71%、平均2.82%，錘度降低1.16～3.36°BX、平均2.67°BX，重力純度降低2.78%～7.74%、平均5.09%，而還原糖則增加0.0%～0.52%、平均0.35%。

甘蔗銹病病情指數為81.1～85.6，平均83.6；甘蔗實測產量相對損失率為17.3%～31.7%，平均24.9%；甘蔗糖分減少1.48%～4.24%、平均3.11%，錘度降低1.38～4.79°BX、平均3.18°BX，重力純度降低3.96%～10.11%、平均6.99%，而還原糖則增加0.02%～0.3%、平均0.1%。

調查及測定結果總體趨勢表明，隨著為害率（病株率或病情指數）上升，產量損失增大，兩者呈極密切相關性。3 種病害發生為害嚴重影響甘蔗品質，導致出糖率降低，噸糖生產成本上升，糖廠經濟效益受損。

2.3 低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害病原類群

分子鑒定結果表明，低緯高原云南蔗區，甘蔗梢腐病病原菌為鐮刀菌F.verticillioides和F.proliferatum，且存在復合侵染現象。7 份復合侵染樣品的F.verticillioides（GenBank登錄號：MZ126549-MZ126555）和F.proliferatum（GenBank 登錄號：MZ102259-MZ102265）序列與GenBank 中公布的F.verticillioides菌株20（GenBank登錄號：KU508286）和F.proliferatum德宏菌株（GenBank 登錄號：KJ629482）的同源性分別為98.6%～100%和100%。系統進化樹顯示，云南甘蔗梢腐病病原菌主要分為F.verticillioides組和F.proliferatum組。F.verticillioides組中，除‘ROC 25’（云南瀾滄）和‘福農10-1405’（云南彌勒）處于一個獨立小分支上外；其余5 個復合侵染樣品與不同地理來源F.verticillioides菌株聚為一組，且與F.oxysporum廣西菌株的親緣關系較近，而所有不同地理來源的F.proliferatum菌株聚為另一組。

分子鑒定結果顯示，低緯高原云南蔗區，甘蔗褐條病病原菌為狗尾草平臍蠕孢B.setariae，其ITS序列(登錄號：MW466590-MW466591)與狗尾草平臍蠕孢B.setariae模式菌株CBS 141.31（登錄號：EF452444）相似性達99.47%，與菌株CBSHN01（登錄號：GU290228）相似性達100%；GPDH 序列(登錄號：MW473721-MW473722)與B.setariae模式菌株CBS 141.31（登錄號：EF513206）相似性達99.83%，與菌株CPC28802（登錄號：MF490833）相似性達100%。基于ITS 和GPDH基因序列構建系統發育樹，發現菌株BS1 和BS2 與B.setariae處于同一分支，親緣關系最近。

分子鑒定結果表明，來源于云南勐海的4 份病樣病原為P.kuehnii，其核苷酸序列（GenBank 登錄號：KP201840-KP201843）與GenBank中登錄的P.kuehnii相應核苷酸序列（GenBank 登錄號：GU058021 和GQ283004-GQ283009）相似性在99.9%以上，并在系統發育樹中聚為一簇；來源于云南保山、臨滄、西雙版納、普洱、文山的53份病樣病原為P.melanocephala，它們的核苷酸序列（GenBank 登錄號：KP201824-KP201839，KU886334-KU886368，KU 896993-KU 896994）與GenBank 中登錄的P.melanocephala相應核苷酸序列（GenBank 登錄號：GU058001 和JX036025）相似性在99.8%以上，在系統發育樹中處于同一分枝。

2.4 甘蔗品種自然抗性

34個主栽品種中，對梢腐病表現高抗到中抗的有18個，占52.9%，感病到高感的有16個，占47.1%；對褐條病表現高抗到中抗的有24個，占70.6%，中感到高感的有10個，占29.4%；對銹病表現高抗到中抗的有25個，占73.5%，中感到高感的有9個，占26.5%。綜合分析結果顯示，‘粵糖83-88’、‘川糖61-408’、‘桂糖21號’、‘云引10 號’、‘柳城03-182’、‘云引58 號’、‘粵糖79-177’、‘云蔗05-51’、‘桂糖36號’、‘新臺糖16號’等10個主栽品種對3 種病害均具有優良抗性；而‘柳城03-1137’、‘桂糖42號’對3種病害均感病（表3）。

由表3可知，60個新品種中，對梢腐病表現高抗到中抗的有35 個，占58.3%，感病到高感的有25 個，占41.7%；對褐條病表現高抗到中抗的有32 個，占53.3%，中感到高感的有28 個，占46.7%；對銹病表現高抗到中抗的有41 個，占68.3%，中感到高感的有19個，占31.7%。綜合分析結果顯示，‘桂糖11-1076’、‘閩糖12-1404’、‘福農09-2201’、‘福農09-71111’、‘桂糖06-1492’、‘桂糖08-1180’、‘云蔗11-1074’、‘桂糖06-2081’、‘桂糖08-1589’、‘粵甘48號’、‘柳城09-15’、‘云蔗11-1204’、‘福農07-3206’等13 個新品種對3 種病害均具有優良抗性；而‘柳城07-506’、‘粵甘52號’、‘海蔗28號’、‘粵甘43號’等4個新品種對3種病害均感病。

表3 甘蔗品種對3種甘蔗病害的自然抗性

續表3

續表3

3 討論

云南是中國第二大糖料基地，地處低緯高原(97°31’E—106°11’E，21°8’N—29°15’N)，氣候復雜多變[1]。近年來多雨高濕甘蔗中后期災害性真菌病害暴發為害成災，減產減糖嚴重[2-3]。而至今有關低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害的種類、病原類群、為害損失及致災因子等研究報道甚少，甘蔗病害的科學有效防控缺乏基礎和科學依據。本研究通過對臨滄、玉溪、版納、普洱、紅河、保山、德宏、文山等低緯高原蔗區調查檢測和測定分析，探明了低緯高原甘蔗中后期災害性真菌病害種類及病原類群，掌握了其為害損失及災害特性，明確了不同甘蔗品種抗病性，為低緯高原甘蔗病害防控提供了依據。調查表明，低緯高原云南蔗區甘蔗中后期災害性真菌病害有甘蔗梢腐病、甘蔗褐條病、甘蔗銹病共3 種，普遍存在梢腐病+褐條病+銹病、梢腐病+褐條病、梢腐病+銹病、褐條病+銹病2 種或3種病害復合侵染現象，且3種病害發生期、災害特性不一，甘蔗銹病6—9月發生、甘蔗梢腐病7—12月發生、甘蔗褐條病8—12月發生，防治上難度大，技術性強。

甘蔗梢腐病可由多種鐮刀菌引起，目前已報道的有7 種，分別為Fusarium sacchari、F.verticillioides、F.proliferatum、Fusarium subglutinans、Fusarium andiyazi、Fusarium incarnatum和Fusarium oxysporum[9-11]。不同國家和蔗區的梢腐病病原菌種群及優勢種存在差異，馬來西亞為F.sacchari、F.proliferatum和F.subglutinans，優勢種為F.sacchari[12]。伊朗為F.verticillioides、F.proliferatum和F.subglutinans，優勢種為F.verticillioides[9-10]。南非為F.sacchari、F.proliferatum和F.andiyazi，優勢種為F.sacchari[33]。菲律賓為F.sacchari、F.proliferatum、F.incarnatum、F.verticillioides和F.subglutinans，優勢種為F.sacchari[11]。本研究查明低緯高原云南蔗區甘蔗梢腐病病原菌為鐮刀菌F.verticillioides和F.proliferatum，優勢種為F.verticillioides，這與Lin等[13]和郭強等[18]的研究結果相吻合。而有關甘蔗褐條病病原菌的研究報道甚少，錢雙宏等[8]報道了海南甘蔗褐條病病原為平臍蠕孢屬Bipolaris。目前，僅有Raza等[34]結合形態及分子鑒定，在廣西、廣東甘蔗葉片病斑上發現狗尾草平臍蠕孢B.setariae，本研究也表明低緯高原云南蔗區甘蔗褐條病病原菌為狗尾草平臍蠕孢B.setariae。本研究在云南勐海蔗區發現引起甘蔗黃銹病的屈恩柄銹菌P.kuehnii，并證實引起甘蔗褐銹病的黑頂柄銹菌P.melanocephala是低緯高原云南蔗區優勢種。P.kuehnii一旦流行常危害成災，澳大利亞和美國每年因此病經濟損失超過17.7億美元和4億美元[35-36]。現今，中國甘蔗抗銹病評價，都只是針對P.melanocephala[26]，今后應調整抗甘蔗銹病育種策略，加強針對P.kuehnii的抗病評價篩選。

研究結果顯示，目前大面積種植和主推的‘粵糖93-159’、‘新臺糖25號’、‘柳城03-1137’、‘桂糖42號’、‘粵糖60號’、‘云引3號’、‘德蔗03-83’、‘新臺糖1號’、‘川糖79-15’等品種高度感病，這是近年低緯高原云南蔗區甘蔗中后期災害性真菌病害暴發成災的主要誘因，部分主栽品種抗性鑒定結果與王澤平等[37]鑒定的抗病性存在差異，如高感品種‘粵糖93-159’、‘柳城03-1137’、‘桂糖42號’在廣西表現為抗病，這是否與各地病菌群體、致病力及鑒定方法有關，尚待進一步研究；而近年選育的‘桂糖11-1076’、‘閩糖12-1404’、‘福農09-2201’、‘福農09-71111’、‘桂糖06-1492’、‘桂糖08-1180’、‘云蔗11-1074’、‘桂糖06-2081’、‘桂糖08-1589’、‘粵甘48 號’、‘柳城09-15’、‘云蔗05-51’、‘云蔗11-1204’、‘福農07-3206’等14 個優良品種（系）高度抗病，建議生產上合理布局大力推廣應用這些抗病品種。

調查及測定結果表明，梢腐病實測產量相對損失率平均為38.43%，最多48.5%；糖分平均降低3.54%、最多5.21%；重力純度平均降低5.37%，最多8.63%。褐條病實測產量相對損失率平均為25.6%，最多32.8%；糖分平均降低2.82%、最多3.71%；重力純度平均降低5.09%，最多7.74%。銹病實測產量相對損失率平均為24.9%，最多31.7%；糖分平均降低3.11%、最多4.24%；重力純度平均降低6.99%，最多10.11%。黃鴻能等[7]指出東莞糖廠蔗區梢腐病為害引起的產量損失在10%～20%，糖分降低0.56%，重力純度降低3%。Dohare 等[38]報道梢腐病為害可導致產量下降24.9%，糖分減低0.56%。由此可見，目前低緯高原云南蔗區甘蔗中后期災害性真菌病害為害造成甘蔗產量及糖分損失十分嚴重，產量損失巨大，嚴重影響甘蔗品質，導致出糖率降低，噸糖生產成本上升，糖廠經濟效益受損。因此，切實加強甘蔗中后期災害性真菌病害精準監測和防控將是甘蔗產業提質增效和高質量發展的重要任務。

4 結論

本研究結果表明，云南低緯高原蔗區甘蔗中后期災害性真菌病害有梢腐病、褐條病、銹病3 種，存在復合侵染；梢腐病菌為鐮刀菌F.verticillioides和F.proliferatum，優勢種為F.verticillioides，褐條病菌為狗尾草平臍蠕孢B.setariae，銹病菌為屈恩柄銹菌P.kuehnii和黑頂柄銹菌P.melanocephala，優勢種為P.melanocephala；34 個主栽品種中，對梢腐病、褐條病和銹病高抗到中抗分別有18 個、24 個、25 個；60 個新品種中，對梢腐病、褐條病和銹病高抗到中抗分別有35個、32個、41個。其中，‘桂糖11-1076’、‘閩糖12-1404’、‘福農09-2201’、‘福農09-71111’、‘桂糖06-1492’、‘桂糖08-1180’、‘云蔗11-1074’、‘桂糖06-2081’、‘桂糖08-1589’、‘粵甘48 號’、‘柳城09-15’、‘云蔗05-51’、‘云蔗11-1204’、‘福農07-3206’等新品種高度抗病。梢腐病、褐條病和銹病實測產量相對損失率平均分別為38.43%、25.6%、24.9%，最多分別為48.5%、32.8%、31.7%；甘蔗糖分平均分別降低3.54%、2.82%、3.11%，最多分別降低5.21%、3.71%、4.24%。