中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與野生群體的種群遺傳學(xué)研究

周華興，段國(guó)慶，江 河，凌 俊，胡玉婷

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031）

0 引言

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)，俗稱河蟹，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、方蟹科、絨螯蟹屬，是重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，口味鮮美，深受人們喜愛。20世紀(jì)70年代末，中華絨螯蟹內(nèi)陸水域人工育苗技術(shù)難關(guān)攻克，增養(yǎng)殖業(yè)有了長(zhǎng)足的發(fā)展[1]。尤其是在20世紀(jì)90年代，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)突飛猛進(jìn)，極大的推進(jìn)了中華絨螯蟹資源的開發(fā)與利用。

中華絨螯蟹是典型的降海洄游型生物，其幼體在江、河等淡水中生長(zhǎng)發(fā)育至成熟個(gè)體后，順?biāo)轮寥牒？诘认趟蟹敝砙2]。長(zhǎng)江入海口淺灘廣闊、資源豐富，是中華絨螯蟹天然的繁育場(chǎng)[3]。野生中華絨螯蟹在長(zhǎng)江口繁殖后，逆流而上，在長(zhǎng)江流域生長(zhǎng)發(fā)育，形成特有的長(zhǎng)江品系，沿江流域也隨之開展了大量的河蟹養(yǎng)殖。然而，養(yǎng)殖過程中大規(guī)模跨地域的引種以及養(yǎng)殖群體的逃逸都可能造成中華絨螯蟹野生群體的種質(zhì)混雜[4-5]。王海華[6]采用線粒體控制區(qū)序列對(duì)長(zhǎng)江水系7 個(gè)野生群體的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，長(zhǎng)江水系中華絨螯蟹各個(gè)群體間分化不顯著，沒有出現(xiàn)與地理分布相對(duì)應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)。李晶晶等[7]利用10個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析了中華絨螯蟹3個(gè)不同水系人工選育群體和1個(gè)野生群體的遺傳分化水平，結(jié)果表明4個(gè)群體的遺傳分化程度處于中低水平。學(xué)者認(rèn)為遺傳漂變的缺失和顯著的同質(zhì)化是造成種質(zhì)混雜的內(nèi)在因素[8]。

為探究中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體對(duì)野生群體的遺傳多樣性影響，本研究采集長(zhǎng)江流域安徽段野生群體樣本以及鄰近的養(yǎng)殖群體樣本，結(jié)合相關(guān)分子學(xué)手段，探究長(zhǎng)江中華絨螯蟹種質(zhì)資源狀況以及資源混雜程度，以期為中華絨螯蟹資源的科學(xué)保護(hù)、合理利用以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)政策的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

研究于2016年采集了江流域安徽段中華絨螯蟹4個(gè)主要養(yǎng)殖區(qū)，分別是蕪湖縣、無為縣、當(dāng)涂縣、宣州區(qū)（如圖1、表1 所示）的養(yǎng)殖樣本共計(jì)140 尾；采集長(zhǎng)江流域蕪湖至馬鞍山段中華絨螯蟹野生樣本30 尾。樣本采集后，取其腿部肌肉保存于-20℃下。實(shí)驗(yàn)于2016年12月—2018年3月，在水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

圖1 樣本采集點(diǎn)分布圖

表1 樣本采集信息表

1.2 基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

取中華絨螯蟹肌肉組織，采用Sambrook法提取基因組DNA[9]。參照NCBI 上已有的中華絨螯蟹線粒體DNA(mtDNA)全序列數(shù)據(jù)（登錄號(hào)：KP126617），使用Oligo7[10]設(shè)計(jì)線粒體COII基因的引物（表2），并委托上海生工生物有限公司合成。

表2 中華絨螯蟹線粒體基因COII引物

PCR 反應(yīng)體系：包含200 ng 的模板DNA，10×Buffer 緩沖液(TaKaRa)5 μL，dNTP(2.5 mM)3 μL，MgCl2(2.5 mol/L)4μL，上下游引物(5μmol/L)各2μL，TaqDNA聚合酶0.75 U，補(bǔ)充無菌超純水至50μL。

PCR 反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，預(yù)期長(zhǎng)度的線粒體DNA 片段通過DNA 純化試劑盒(DNA Gel Extract Purification Kit,TaKaRa)回收后，委托上海生工生物有限公司雙向測(cè)序。

1.3 序列分析

測(cè)序所得序列通過Seqman 軟件輔助人工進(jìn)行拼接組裝。序列通過MAFFT v.7[11]在線比對(duì)后，使用DNAsp v.6.11[12]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd) 和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,Pi)。使用Arlequin v.3.11 進(jìn)行分子變異分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)[13]。使用 Mega v.7.0[14]基于鄰接法(Neighbour joining,NJ)構(gòu)建單倍型分子系統(tǒng)樹。采用Network 5000 基于中介網(wǎng)絡(luò)法(Median Joining,MJ)繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

測(cè)序獲得170條長(zhǎng)度為799 bp的中華絨螯蟹線粒體COII基因序列，共檢測(cè)到突變位點(diǎn)38個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)10個(gè)，單突變位點(diǎn)28個(gè)。基因片段中，T、C、A、G四個(gè)堿基的平均含量分別為35%、19.4%、31.2%、14.4%。A+T 的含量為66.2%，大于G+C 的含量33.8%。基因序列出現(xiàn)了明顯的反G偏倚(Anti-G bias)現(xiàn)象[16]。

2.2 單倍型進(jìn)化分析

中華絨螯5個(gè)群體中共檢測(cè)出12種單倍型，其中XZ 群體有7 種單倍型，WH 群體有6 種單倍型，DT 和WW群體均有5種單倍型，YS群體有4種單倍型（見表3）。12種單倍型中，Hap 6、11、12為群體特有單倍型，其余9個(gè)單倍型均為群體共享單倍型。

表3 中華絨螯蟹5個(gè)群體單倍型和遺傳多樣性信息

選擇日本絨螯蟹COII序列（登錄號(hào)：NC_011597）作為外類群，構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，Hap12獨(dú)立成支，其余11個(gè)單倍型聚為一支。單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析結(jié)果表明，Hap 1 和2 包含了所有的群體，且Hap 2的共享個(gè)體數(shù)最多，為98個(gè)。除Hap 12外（突變步數(shù)為30），其余11個(gè)單倍型間的突變步數(shù)均為1（圖2）。

圖2 12個(gè)單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹（左）和中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（右）

2.3 遺傳多樣性和分子變異分析

種群遺傳多樣性分析結(jié)果表明DT群體單倍型多樣性最高，XZ 群體核苷酸多樣性最高；WW群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低，分別為0.4090和0.0006。野生中華絨螯蟹YS 群體的單倍型多樣性為0.5450，核苷酸多樣性為0.0008，僅高于WW群體。

分子變異分析結(jié)果表明，群體內(nèi)的分子變異為96.54%，遠(yuǎn)高于群體間的變異(3.46%,P＜0.05)（表4）。群體間的平均遺傳分化指數(shù)Fst值為0.0346，說明多個(gè)群體間沒有出現(xiàn)遺傳分化[17]。

表4 種群分子變異分析

3 討論

3.1 長(zhǎng)江野生中華絨螯蟹遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物群體抗逆和進(jìn)化的潛在動(dòng)力，也是種群適應(yīng)外界環(huán)境能力最直觀的反映[18]。群體的遺傳多樣性水平往往受到多種因素的影響，如譜系分選、特殊的生活史等[19-20]。中華絨螯蟹作為重要的水產(chǎn)品，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其自然群體受到人類活動(dòng)的影響較大。

中華絨螯蟹線粒體COII基因序列中，A+T的含量為66.2%，G+C 的含量為33.8%，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏倚。有學(xué)者基于線粒體COI基因序列的中華絨螯蟹野生群體遺傳多樣性分析[21]中，A+T 的含量為61.7%，G+C 的含量為38.3%，這與本研究的結(jié)果相印證。本研究中，長(zhǎng)江蕪湖-馬鞍山江段的野生中華絨螯蟹遺傳多樣性水平較低(Hd=0.5450;Pi=0.0008)，低于2008 年報(bào)道的長(zhǎng)江南京江段中華絨螯蟹群體遺傳多樣性(Hd=0.8433;Pi=0.0048)[22]和2016 年報(bào)道的長(zhǎng)江口中華絨螯蟹群體遺傳多樣性(Hd=0.8333;Pi=0.0077)[21]。這說明長(zhǎng)江流域中華絨螯蟹群體近年來出現(xiàn)了種質(zhì)退化現(xiàn)象。王海華[6]通過系統(tǒng)分析長(zhǎng)江中華絨螯蟹資源變動(dòng)以及資源危機(jī)爆發(fā)原因，提出長(zhǎng)江中華絨螯蟹主要致危因素有水利工程、湖泊圍墾、水質(zhì)污染和酷魚濫捕。野生中華絨螯蟹群體遺傳多樣性的下降弱化了其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，最終可能導(dǎo)致野生資源的衰退。

3.2 中華絨螯蟹養(yǎng)殖和野生群體種群遺傳分化

采樣調(diào)研結(jié)果表明，4 個(gè)養(yǎng)殖群體的中華絨螯蟹繁殖親本來源差異較大，其中DT 群體的親本主要來自當(dāng)涂縣石臼湖；WW群體的親本主要來自常州市長(zhǎng)蕩湖；WH 群體的親本主要來自如東縣；XZ 群體的養(yǎng)殖品種為選育新品種‘長(zhǎng)江2 號(hào)’，其親本來自萊茵河水系。然而，多個(gè)群體間并未檢測(cè)到明顯的遺傳分化。研究中，單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化分析和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，Hap 1-11 形成一支，為并系關(guān)系；Hap 12 形成單獨(dú)的進(jìn)化支，可能是萊茵河水系中華絨螯蟹的遺傳特征；5 個(gè)群體未出現(xiàn)明顯的譜系分化。群體間的平均遺傳分化指數(shù)Fst值為0.0346，說明多個(gè)群體間沒有出現(xiàn)遺傳分化。AMOVA 分析結(jié)果表明，不同群體間的遺傳變異遠(yuǎn)小于群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異。

5 個(gè)群體間沒有明顯的遺傳差異，但養(yǎng)殖群體親本來源差異大，說明養(yǎng)殖群體和野生群體間存在嚴(yán)重的種質(zhì)混雜。Chang 等[4]也曾報(bào)道過長(zhǎng)江野生中華絨螯蟹種質(zhì)可能受其他水系污染。研究中采集的養(yǎng)殖場(chǎng)毗鄰長(zhǎng)江干流，在雨水充足的季節(jié)，養(yǎng)殖場(chǎng)易被洪水淹沒。而相比其他水產(chǎn)動(dòng)物，中華絨螯蟹的運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)[23]，可借助水流從養(yǎng)殖場(chǎng)四散爬出，最終匯入長(zhǎng)江干流。這種養(yǎng)殖逃逸可能是造成長(zhǎng)江中華絨螯蟹種質(zhì)混雜的主要原因。

4 結(jié)論

本研究采集長(zhǎng)江流域安徽段中華絨螯蟹野生群體樣本以及鄰近的養(yǎng)殖群體樣本，基于線粒體COII基因序列，開展了種群遺傳學(xué)分析。結(jié)果表明，長(zhǎng)江流域中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體與野生群體間未出現(xiàn)顯著的遺傳分化，野生群體基因庫(kù)可能受到養(yǎng)殖群體的影響，種質(zhì)混雜現(xiàn)象嚴(yán)重。與前人研究結(jié)果相比，近年來中華絨螯蟹長(zhǎng)江野生群體遺傳多樣性下降，資源衰退，建議加大野生資源的保護(hù)力度，堅(jiān)持保護(hù)優(yōu)先原則。